金银花与山银花绿原酸提取动力学比较研究

杨姣　贺福元　刘惠　张雨恬　周逸群　肖美凤　杨岩涛　周晋

摘要：目的 利用已建立的中药材成分封闭体系提取动力学模型，探讨金银花与山银花绿原酸的提取动力学差异。方法 采用HPLC测定金银花与山银花绿原酸有效含量W0及分配系数ρ2，采用吸水法测定工艺参数V1、V2再计算V0，利用SPSS19.0软件非线性拟合得到参数M、N、L、α、β、π，用Excel2016按公式计算k、k1′、k2′、ρ1、tmax、cmax、AUC、P%、D%。运用总量统计矩相似度法计算两者的相似度。结果 金银花的V0、V1、V2分别为18.69、9.50、30.20 mL，金銀花绿原酸W0为3.75%、ρ2为0.884；山银花的V0、V1、V2分别为12.79、7.80、37.00 mL，山银花绿原酸W0为5.67%、ρ2为1.020。金银花与山银花绿原酸药时曲线呈三室模型，其主要提取动力学参数k分别为0.110 1、0.3755 h-1，k1′分别为3.632、3.288 h-1，k2′分别为53.12、55.28 h-1，ρ1分别为2.731、2.751，tmax分别为0.299 5、0.216 3 h，cmax分别为0.134 0、0.252 7 mg/mL，AUC分别为3.405、1.560 h，P%分别为35.73%、44.57%，D%分别为0.916 2%、2.680 7%。总量统计矩相似度为0.963 8，表明金银花与山银花绿原酸提取动力学行为基本相似。结论 金银花与山银花绿原酸的溶出行为及其差异可以用中药提取动力学数学模型客观且有效地表达，本研究可以为进一步开展金银花与山银花提取工艺的优化及其制剂研究提供一定参考。

关键词：金银花；山银花；绿原酸；提取动力学模型；封闭体系；总量统计矩相似度

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0091-05

Abstract： Objective To explore the extraction kinetic deviation of the chlorogenic acid （ChA） in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos through established extract kinetic model of closed system of Chinese materia medica. Methods The content of ChA （W0） and ρ2 in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos were determined by HPLC； The V1 and V2 were measured by water absorbing further to calculate V0； The value of M， N， L， α， β， and π were estimated by curve fitting using SPSS19.0 edition； The extraction kinetic parameters k， k1′， k2′， ρ1， tmax， cmax， AUC， P%， and D% were calculated by Excel； their similarity was calculate by the total quantum statistical moment similarity （TQSMS）. Results The V0， V1， and V2 for Lonicerae Japonicae Flos were 18.69， 9.50， and 30.20 mL， respectively. The W0 for the ChA in Lonicerae Japonicae Flos were 3.75%， and ρ2 was 0.884； The V0， V1， and V2 for Lonicerae Flos were 12.79， 7.80， and 37.00 mL， respectively. The W0 for the ChA in Lonicerae Flos were 5.67%， and ρ2 was 1.020； The extraction kinetic profiles for ChA in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos were fitted three compartment model. The main kinetic parameters as k were 0.1101， 0.3755 h-1； k1′ were 3.632， 3.288 h-1； k2′ were 53.12， 55.28 h-1； ρ1 were 2.731， 2.751； tmax were 0.299 5， 0.216 3 h； cmax were 0.134 0， 0.252 7 mg/mL； AUC were 3.405， 1.560 h； P% were 35.73% and 44.57%； D% were 0.916 2% and 2.680 7%， respectively. Their TQSMS was 0.963 8， which indicated that the extraction kinetics of ChA in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos had good similarity. Conclusion The extraction kinetic model described the dissolution behavior and deviation of extraction kinetic profiles for ChA in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos objectively and effectively. This research can provide some references for further study on extraction processes and preparation of Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos.

Keywords： Lonicerae Japonicae Flos； Lonicerae Flos； chlorogenic acid； extraction kinetic model； closed system； total quantum statistical moment similarity

中药材由于生物体组织构成及成分的复杂性和多样性，影响其提取因素众多，但其综合效果可用提取动力学数学模型及参数表达。中药成分从药材组织中溶出经历3个阶段[1-2]：首先，溶剂向药材内部渗透和药材的润湿，即浸润解吸；其次，依靠溶质的溶剂化等将溶质溶解到固液界面上，即置换溶解；最后，溶质从药材内部向药材表面以及由药材表面向溶液主体的扩散，即传质扩散。根据提取方式可分为封闭体系（成分在提取过程中不被溶媒带出提取体系，如浸渍法、回流法、煎煮法等）和开放体系（成分在提取过程中被溶媒带出提取体系，如水蒸气蒸馏法、渗漉法、索氏提取法等）。据此，前期研究建立了一系列适合中药材成分提取动力学的数学模型[3]，该模型充分地考虑到了中药材吸水膨胀、存在药材内透细胞膜传质扩散、中药成分消除分解的实际情况，并进行了详细的实验[2，4]。

金银花与山银花药用历史悠久，始载于南朝陶弘景的《名医别录》。依据2015年版《中华人民共和国药典》[5]，金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花；山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.和黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花。两者原同属金银花，具有清热解毒、疏散风热功效，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等病症。绿原酸作为金银花和山银花药材质量控制的指标性成分之一，药理研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降脂、降糖等作用[6-9]。本研究针对金银花与山银花的“异质等效”现象[10]，以金银花和山银花绿原酸为模型成分，采用回流提取方式，根据本实验室已建立的中药材成分封闭体系提取动力学模型，测定金银花与山银花绿原酸提取动力学参数，并对参数进行分析，以此探讨二者的绿原酸提取动力学差异，旨在揭示金银花与山银花在异质成分环境中绿原酸的提取动力学行为，为进一步论证金银花与山银花的“异质等效”现象提供试验基础。

1 封闭体系中药提取动力学数学模型及参数求解

1.1 封闭体系的数学模型

运用FICK定律、固体制剂Noyes-whitney溶出理论及动力学理论可建立微积分方程组，此方程组为封闭系，是中药提取的基础方程组[2-3]。

上述诸式中，α、β、π为混杂参数，其中α为快置扩散速度常数，β为慢置消除速度常数，π为慢置扩散速度常数，α、β、π分别代表3个指数项即2个两室间扩散和1个消除的特征，由强度性工艺参数k、k1′、k2′、ρ1、ρ2、A1、A2及容量性工艺参数V0、V1、V2决定，而与有效成分含量W0无关。M、N、L、α、β、π由k1′、k2′、A1、A2、C00（W0/V0）决定。

1.2 参数的测定及计算

1.2.1 需测定参数

包括有效成分含量W0、药材细胞室溶液体积V0、质外体室溶液体积V1、溶液室溶液体积V2、分配系数（平衡时质外体室与溶液室成分浓度之比）ρ2，以及采集不同时间t样品液含量C2t。

1.2.2 需计算的参数

首先用SPSS19.0软件的曲线迭代法进行参数优化估算求得M、N、L、α、β、π，再根据公式计算参数k、k1′、k2′、ρ1、tmax、cmax、AUC、P%、D%。

2 仪器与试药

Waters 1525 Binary HPLC Pump，Breeze色谱工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，Waters 2410 Refractive Index Detector，H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），EKUP-II-20T型超纯水系统（长沙市科临电子科技有限公司）

金银花（委托本校第一附属医院药剂科定点采购）、山银花（购于湖南隆回），经湖南中医药大学药学院中药炮制教研室石继连副教授鉴定，分别为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.及灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾或带初开的花。绿原酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，HPLC纯度≥98%，批号R05F6F1），乙腈（色谱纯，美国Tedia公司，Lot 17065164），磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20170313）。

3 方法

3.1 色谱条件

Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.4%磷酸溶液-乙腈（87∶13），流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为327 nm，柱温为30 ℃。

3.2 供试品溶液制备

3.2.1 对照品溶液配制

取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，用甲醇配制成0.078 mg/mL的绿原酸对照品溶液。

3.2.2 有效成分含量W0的测定

分别取金银花和山银花，粉碎并过4号筛，取1 g，精密称定，置于250 mL圆底烧瓶内，加入100 mL甲醇，加热回流提取1 h，过滤，所得滤液4 ℃保存，待进样测定。

3.3 药材细胞室溶液体积V0、质外体室溶液体积V1、溶液室溶液体积V2的测定

分别取金银花和山银花各5 g，精密称定，置于250 mL圆底烧瓶内，称重得W1，加入近沸腾的纯水100 mL，称重得W2，加热回流提取2 h，倾出水液至沥尽，所得水液体积为V2，其吸水膨胀的药材采用离心法[11]测定，得到V1，再根据公式V0+V1=（W2-W1）÷d-V2得到V0。

3.4 分配系数ρ2的测定及ρ1的计算

取上述金银花与山银花溶液室及质外体室药液，测定绿原酸含量，即得溶液室和质外体室药液中绿原酸含量，分别为C2、C1。按公式ρ2=C1/C2计算得到ρ2，再按公式（2）计算得到ρ1。

3.5 不同时间样品液的采集及含量测定

分别取金银花与山银花各10 g，精密称定，置于三口圆底烧瓶中，加入近沸腾纯水220 mL，两口用塞子密闭，另一口接冷凝管，整个装置置于可调电压（0～300 V）的电热套内，马上打开电热套加热至滴下第一滴回流液时开始计时，分别于5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min定时取得各时间点2 mL样品液，并补充等量纯水。样品液4 ℃保存，待进样测定。

3.6 方法学考察

3.6.1 线性范围考察

精密吸取绿原酸对照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于量瓶中，加入甲醇至5 mL，得0.007 8、0.015 6、0.023 4、0.031 2、0.039 0 mg/mL各浓度溶液。按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到回归方程Y=4.68×10-7X-208 397（r=0.999 4），线性范围为1.56×10-4～7.80×10-4 g。

3.6.2 精密度试验

分别精密吸取金银花和山银花溶液室溶液各20 μL，按上述色谱条件测定，重复进样6次，测定绿原酸峰面积，得到金银花与山银花中绿原酸峰面积的RSD分别为4.88%、4.51%，表明仪器精密度良好。

3.6.3 重复性试验

分别取同一批金银花、山银花，按“3.2.2”项下方法分别制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样20 μL测定，计算得到RSD分别为1.82%、2.11%，表明该方法重复性良好。

3.6.4 稳定性试验

室温条件下，分别取金银花和山银花的5 min时样品液作为供试品溶液，分别于0、8、12、24、48 h时按上述色谱条件进样20 μL测定，计算其RSD，分别为2.81%，3.50%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

3.6.5 加样回收率试验

分別精密吸取金银花和山银花溶液室溶液100 μL各6份，再精密加入一定量的对照品溶液，混匀，按上述色谱条件进行测定并计算回收率，得到金银花与山银花中绿原酸的平均回收率分别为99.43%，98.56%，RSD分别为4.18%、3.79%，表明该方法准确可靠。

4 结果

4.1 金银花与山银花绿原酸提取工艺参数测定结果

按“3.2”“3.3”“3.4”项下操作，取样品液，过0.45 μm微孔滤膜，按上述色谱条件进样测定并计算。得到金银花绿原酸W0=3.75%，ρ2=0.884，V0=18.69 mL，V1=9.50mL，V2=30.20 mL；山银花绿原酸W0=5.67%，ρ2=1.02，V0=12.79mL，V1=7.80 mL，V2=37.00 mL。

4.2 不同时间金银花与山银花绿原酸含量测定

按“3.5”项下方法，取样品液过0.45 μm微孔滤膜，按上述色谱条件进样测定，得到不同时间金银花与山银花绿原酸HPLC色谱图见图1、图2，提取动力学药时曲线见图3。

4.3 曲线拟合及参数计算

根据金银花与山银花中绿原酸提取动力学的药时数据，先用残差法再采用SPSS19.0多元曲线非线性参数估计可得回归方程M、N、L、α、β、π值，结果见表1；按文献[2-3]中提取动力学参数公式与步骤，采用Excel2016软件计算各工艺参数k、k1′、k2′、ρ1、AUC、tmax、cmax、P%、D%，结果见表2。最后进行总量统计矩相似度计算[12-14]。

5 讨论

本研究在前期建立的中药材成分封闭体系提取动力学模型基础上展开金银花与山银花中绿原酸在回流提取过程中动力学的差异研究。首先，从表1来看，金银花与山银花绿原酸提取动力学符合三室模型（P<0.01）。其次，从金银花与山银花绿原酸提取动力学药时曲线来看，山银花绿原酸含量均高于金银花绿原酸含量，且均符合2015年版《中华人民共和国药典》中金银花绿原酸含量不得少于1.5%、山银花绿原酸含量不得少于2.0%的规定。再者，金银花与山银花绿原酸的ρ1、ρ2均不为1，表明各室的表观浓度各不相等；其中ρ2为实验所测，提取过程中有效成分溶出愈多，其值愈小，本实验中金银花绿原酸ρ2（0.884）<山银花绿原酸ρ2（1.020），由此可推知，金银花绿原酸成分溶出高于山银花绿原酸。从P%、D%来看，山银花绿原酸的提取率（44.57%）明显高于金银花绿原酸（35.73%），但金银花绿原酸的损失率（0.916 2%）却低于山银花绿原酸（2.680 7%），这可能是由于绿原酸随着加热时间增长而有所分解[15]，山银花绿原酸分解较金银花绿原酸分解程度高，导致浓度变化较大，故损失也较大。直观可以看出，金银花与山银花绿原酸的提取动力学参数存在一定差异，但通过对金银花与山银花绿原酸进行总量统计矩相似度[12-13]计算，两者的相似度为0.963 8，大于总量统计矩相似度界值0.874 9[14]，表明两者的提取动力学行为基本相似。

综上所述，金银花与山银花绿原酸的溶出行为及其差异可以用中药提取动力学数学模型客观且有效地表达。进行金银花与山银花的提取动力学研究可以为后期进一步开展金银花与山银花提取工艺的优化及其制剂研究提供一定参考。通过实验发现，本研究尚存在一些不足之处，如药材批次较少，模型成分只选择了一种有效成分，鉴于此，后期会增加药材批次，并结合质谱等筛选出更多合适的标志物，更全面、深入地开展金银花与山银花的提取动力学研究。

参考文献：

[1] 储茂泉，刘国杰.中药提取过程的动力学[J].药学学报，2002，37（7）：559-562.

[2] 贺福元，邓凯文，罗杰英，等.中药复方成分提取动力学数学模型的初步研究[J].中国中药杂志，2007，32（6）：490-495.

[3] 贺福元，邓凯文，杨大坚，等.中药材成分提取动力学数学模型的建立及参数分析[J].数理医药学杂志，2005，18（6）：513-517.

[4] 贺福元，邓凯文，吴德智，等.左金方与黄连中小檗碱型生物碱提取动力学差异性的研究[J].中成药，2009，31（9）：1354-1359.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：30-31，221.

[6] 林学政，柳春燕，陈靠山，等.不同地域牛蒡叶绿原酸的含量比较及其抑菌实验[J].天然产物研究与开发，2004，16（4）：328-330.

[7] 胡克杰，孙考祥，王璟璐，等.氯原酸体外抗病毒作用研究[J].哈尔滨医科大学学报，2001，35（6）：430-432.

[8] 张鞍灵，马琼，高锦明，等.绿原酸及其类似物与生物活性[J].中草药， 2001，32（2）：173-176.

[9] 王强，陈东辉，邓文龙.金银花提取物对血脂与血糖的影响[J].中药药理与临床，2007，23（3）：40-42.

[10] 贺福元，贺红，邓凯文，等.借超分子“印迹模板”的自主作用解开金（山）银花纷争[J].中国中药杂志，2016，41（6）：1152-1160.

[11] 王震宇，陶洪斌，唐玉林.植物质外体的研究方法[J].植物生理学通讯，1999，35（5）：394.

[12] 贺福元，罗杰英，邓凯文.中药复方动力学数学模型-总量统计矩法的研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，8（6）：13-18.

[13] 黄胜，贺福元，刘文龙，等.总量统计矩相似度法对左金缓释片多成分释放相似度的评价研究[J].中成药，2009，31（1）：35-39.

[14] 賀福元，邓凯文，黄胜，等.总量统计矩标准相似度数学模型的建立及应用研究[J].药学学报，2013，48（9）：1453-1458.

[15] 张丹，李章万，姜焱.HPLC测定金银花、菌陈及其10种中成药中绿原酸的含量[J].药物分析杂志，1996，16（2）：83-85.

（收稿日期：2017-11-23）

（修回日期：2017-12-21；编辑：陈静）