柳茶总三萜提取富集工艺优化及抗缺氧活性研究

王昕　葸慧荣　杨芳芳　何蕾　马慧萍

摘要：目的 优选藏药柳茶总三萜的提取富集工艺并研究其抗缺氧活性。方法 通过小鼠常压密闭缺氧实验筛选柳茶总三萜的提取溶剂；再以总三萜含量、提取率为评价指标，采用正交试验考察提取时间、提取次数、料液比，优选柳茶总三萜的提取工艺；然后考察大孔吸附树脂类型、上样浓度、洗脱剂浓度、洗脱剂体积，优选其富集工艺；最后通过小鼠常压密闭缺氧实验和急性减压缺氧实验研究其抗缺氧活性。结果 优选的提取工艺为：70%乙醇提取，料液比为1∶20，提取2次，每次1.5 h，平均总三萜含量可达32.25%；优选的富集工艺为：AB-8型大孔吸附树脂，上样浓度为2 mg/mL，80%乙醇5 BV洗脱，总三萜含量可达61.09%；柳茶总三萜抗缺氧活性较强，且存在一定的剂量依赖性。结论 本研究优选的柳茶总三萜提取富集工艺稳定、重现性好，所得柳茶总三萜具有显著的抗缺氧活性。

关键词：柳茶；总三萜；提取工艺；富集工艺；抗缺氧

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.015

中图分类号：R284.2；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0071-06

Abstract： Objective To optimize the extraction and enrichment process of total triterpenes from Sibiraea Angustata； To study its anti-hypoxia activity. Methods The extraction solvent of total triterpenoids of Sibiraea Angustata was screened by atmospheric pressure anti-hypoxia test. The content of total triterpenes and extraction rate were set as evaluation indexes. The effects of extraction time， extraction times and ratio of material to liquid on extraction were investigated by orthogonal test. The extraction process was optimized. Resin type， concentration of sample， eluent concentration and eluent volume were investigated to optimize the enrichment process of total triterpenes of Sibiraea Angustata. Finally， the anti-hypoxia activity was studied by atmospheric pressure test and acute decompression test. Results The optimum extraction process was as follows： 70% ethanol extraction， the ratio of material to liquid was 1：20， extrat 2 times with 1.5 h for each time， and the content of total triterpenes was 32.25%. The optimum enrichment process was： AB-8-type macroporous adsorption resin， the loading concentration of 2 mg/mL， 80% ethanol 5 BV elution， and total triterpenes content was up to 61.09%； Sibiraea Angustata total triterpenes anti-hypoxia activity test was strong， and had a certain dose dependency. Conclusion The extraction and enrichment process of total triterpenes from Sibiraea Angustata is stable， reproducible and has significant anti-hypoxia activity.

Keywords： Sibiraea Angustata； total triterpenes； extraction process； enrichment process； anti-hypoxia

柳茶是薔薇科Rosaceae鲜卑花属Sibiraea Maxim植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand-Mazz.的叶和嫩枝，是我国藏族民间传统药材，生长在海拔3000～5000 m的高原地带，分布在青海、西藏、云南及甘肃等地区，资源丰富。民间将窄叶鲜卑花作为茶饮，因其形状似柳叶，故称“柳茶”。其功效为疏散风热，治疗食积居多[1]。由于特殊的生长环境，长期地理气候的剧变导致柳茶体内的微量元素种类和数量的分布也发生了一些新的变化[2]。柳茶中的化学成分以三萜类为主[3]，主要包括熊果酸、齐墩果酸。此外，还含有部分单萜[4-8]、黄酮类和挥发油等成分。有研究报道齐墩果酸和熊果酸均具有清除超氧阴离子、羟自由基和DPPH自由基的作用[9-10]，临床主要用于消炎、保肝[11]、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂[12-13]、抗肿瘤[14]等，这些作用大多与其清除自由基与抗氧化活性相关。但是，关于柳茶三萜类化合物的抗缺氧作用目前尚未见相关报道。本研究首先通过常压密闭缺氧实验筛选柳茶总三萜的提取溶剂，采用正交试验优选其提取工艺，然后采用大孔吸附树脂优选富集工艺，最后通过常压密闭缺氧实验和急性减压缺氧实验研究其抗氧化活性，为藏药柳茶的深入研究奠定基础。

1 仪器、试药与动物

UV2800SPC紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器公司），Spectramax i3多功能酶标仪（Molecular Devices公司），AE240型万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），SK3300L超声清洗仪器（上海精密仪器仪表有限公司），RE-3000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），BHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），HH-4电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司），AFX20501-P超纯水机（重庆艾科浦外贸颐洋企业发展有限公司），800型离心机（上海手术器械厂）。

柳茶药材购于甘肃省甘南藏族自治州合作市郊（海拔3200 m以上），经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科Rosaceae鲜卑花属植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand-Mazz.的叶。乙酰唑胺原料药（武汉远城科技发展有限公司，批号100114，纯度≥98%），熊果酸对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号20161213，纯度≥98%）；HPD500、AB-8、DA201、D101、LX-60大孔吸附树脂（北京索莱宝科技有限公司）。乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

清洁级BABL/C雄性小鼠，体质量（20±2）g，5周龄，兰州军区陆军总医院动物实验科提供，动物许可证号SYXK（军）2014-0029。动物自由摄食饮水。饲养室保持良好通风，控制环境温度24～26 ℃、相对湿度50%～60%，12 h循环光照。

所有数据均采用SPSS20.0统计软件进行分析。

2 方法与结果

2.1 柳茶总三萜含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

取熊果酸标准品2.00 mg，用甲醇超声溶于20 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的制备

取0.1、0.2、0.3、0.6、0.8、1.0 mL对照品溶液，水浴挥干溶剂，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，摇匀，加入高氯酸1.2 mL，60 ℃水浴15 min，取出，冷却至室温，加入5 mL冰乙酸，混匀后以显色剂为空白于546 nm波长处测定吸光度（显色30 min内测定）。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=3.264 5X+0.043 7（r=0.999 2）。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取柳茶提取样品4 mg于10 mL容量瓶中，甲醇超声溶解。取0.5 mL各供试品，按“2.1.2”项下方法进行测定，于546 nm波长处测定吸光度，计算总三萜含量。

2.2 吸水率考察

称取药材5.0 g，分别称取3份，加25 mL水完全浸润，過滤，称重，计算吸水率。吸水率（%）=（药材湿重-药材干重）÷药材干重×100%。结果见表1。吸水率为187.44%，因此初次加水需加2倍量的水。

2.3 小鼠常压密闭缺氧实验筛选提取溶剂

称取柳茶药材25 g，分别加入水、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇提取，提取温度为80 ℃，每次提取2 h，提取2次，合并提取液。减压浓缩后挥发去溶剂，采用真空冷冻干燥制成细粉待用。将小鼠随机分成缺氧模型组、水提取物组、70%乙醇提取物组、80%乙醇提取物组和95%乙醇提取物组，各给药组灌胃剂量为500 mg/kg（药液浓度10 mg/mL，灌胃体积1 mL），缺氧模型组给予等量生理盐水，各组均灌胃5 d。最后一次给药后60 min，将各组小鼠放入250 mL广口瓶（瓶中事先放入5 g碱石灰，用于吸收二氧化碳与水分，并且在瓶底放入适量滤纸吸取尿液与粪便），在瓶口涂抹凡士林进行密闭，随后开始计时，当小鼠呼吸停止时结束计时，记录小鼠在密闭实验瓶中的存活时间。延长率（%）=（药物组存活时间-模型组存活时间）÷模型组存活时间×100%，结果见表2。可见，70%乙醇提取物抗缺氧活性最好，因此确定70%乙醇为提取溶剂。

2.4 正交试验优选提取工艺

以总三萜含量、提取率为评价指标，采用L9（34）正交试验，根据预试验确定的提取温度为80 ℃，考察料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）3个因素对提取结果的影响。提取因素水平见表3。

2.4.1 正交试验结果及分析

正交试验采用多指标进行统计分析，评分采用加权法进行处理。综合评分=总三萜含量×0.5+提取率×0.5。正交试验结果见表4，方差分析见表5。各因素对提取结果的影响大小为B>A>C，其中B（提取温度）对结果影响最大，因此，确定最佳工艺为A1B2C2，即提取温度为80 ℃，加入20倍量70%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

2.4.2 提取工艺验证试验

精确称取柳茶25 g，根据优化的提取工艺进行提取，重复工艺条件3次，计算总三萜含量和提取率，再将提取物以500 mg/kg予小鼠灌胃，通过常压密闭缺氧实验验证抗缺氧活性，结果见表6。结果表明正交试验所得的工艺稳定，重复性好，结果可靠。

2.5 大孔吸附树脂优化富集工艺

2.5.1 不同型号大孔吸附树脂筛选

将预处理过的5种大孔吸附树脂（型号分别为D101、HPD200、HPD500、AB-8、LX-60）分别称取2.00 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加入样品溶液40 mL，以一定的速度振摇，每隔5 min摇30 s，持续振摇1 h，静置8 h后进行过滤。取滤液0.5 mL，按“2.1.2”项下方法进行测定，计算总三萜的剩余量和吸附量。

将过滤后的树脂置于125 mL容量瓶中，加入95%乙醇40 mL，于20 ℃以一定速度振摇，每隔5 min摇30 s，持续振摇1 h，静置4 h充分解吸附，收集滤液，取滤液0.5 mL，按“2.1.2”项下方法进行测定，计算总三萜的剩余量和吸附量，结果见表7。

结果表明，AB-8型和D101型树脂的吸附率较高，而AB-8型树脂的解析率较高，因此选用AB-8型树脂进行柳茶总三萜的富集。

2.5.2 上样浓度对柳茶总三萜吸附的影响

将提取的柳茶粉末配成浓度分别为0.8、1、2、4、5 mg/mL的溶液，选用AB-8型树脂，各浓度溶液上样量200 mL，吸附2 h后，用95%乙醇同条件洗脱，收集洗脱液，测定总三萜含量。结果见图1。可见，上样浓度为2 mg/mL时，AB-8树脂对药材的吸附率最高，因此选用2 mg/mL为上样浓度。

2.5.3 洗脱剂浓度对柳茶总三萜解析的影响

取AB-8型树脂，上样量200 mL，浓度为2 mg/mL，吸附2 h后，以2 BV蒸馏水冲洗，再分别以2 BV的浓度分别为10%、30%、50%、80%、95%乙醇梯度洗脱，收集不同浓度的洗脱液，测定总三萜含量。结果见图2。可见，80%乙醇洗脱液中总三萜的含量最高，因此选择80%乙醇进行洗脱。

2.5.4 乙醇洗脱体积对柳茶总三萜解析的影响

取等量的AB-8树脂湿法上柱，上样量为200 mL，上样浓度为2 mg/mL，分别吸附2 h后，以2 BV蒸馏水洗脱，再用80%乙醇以1、2、3、4、5、6、7 BV体积洗脱，收集所有洗脱液，测定总三萜含量，结果见图3。可见，当以5 BV体积洗脱树脂时，总三萜的洗脱率最大，而当再增加洗脱剂体积时，总三萜的洗脱率基本无变化，因此选择以5 BV体积的80%乙醇进行洗脱。

2.6 抗缺氧活性验证

2.6.1 小鼠常压密闭缺氧实验

将小鼠，随机分为缺氧模型组、阳性药组（乙酰唑胺，灌胃剂量为350 mg/kg）及柳茶总三萜高、中、低剂量组（灌胃剂量分别为375、250、125 mg/kg），每组10只。各组均连续灌胃5 d。按“2.3”项下方法进行常压密闭缺氧实验，验证柳茶总三萜的抗缺氧活性，结果见表8。与缺氧模型组比较，柳茶总三萜高、中、低剂量组差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），表明其抗缺氧活性较强。

2.6.2 小鼠急性减压缺氧实验

小鼠分组方法与“2.6.1”项下相同，各组小鼠灌胃5 d，最后一次灌胃结束后50 min，将小鼠置于高原低压低氧模拟氧舱中，将海拔升至10 000 m，停留1 h后，计算小鼠死亡率，结果见表9。可见，柳茶总三萜富集物具有较强的抗缺氧活性，并且其抗缺氧活性呈现一定的剂量依赖性。

3 讨论

传统溶剂提取方法主要包括煎煮法、浸渍法、回流法和渗漉法[15]，选择不同的提取方法需要从经济、提取效率、实验周期等多方面考虑。中药提取时合理的提取工艺和指标的选择能够有效地评价工艺的优良[16]。本试验在前期预试验基础上，采用回流法提取柳茶总三萜，选择提取温度为80 ℃，正交试验对料液比、提取时间、提取次数3个常见影响因素进行考察。在这3种因素中，料液比的增加可以提高溶剂与药材的接触面积，加速有效成分的浸出，基于前期试验结果，本试验从有效成分的浸出率以及经济方面考虑，选取料液比为1∶10、1∶15、1∶20进行考察；提取时间可以改变药物的有效成分从细胞壁中分离的时速，但是，提取时间过长会使药物中有效成分的结构发生改变而被破坏。一般药材在提取2 h以上药液中有效成分的浓度不会再显著提高，因此，从保护有效成分的角度出发，选取提取时间为2、1.5、1 h进行考察；提取次数增多可以提高有效成分在药液中的浓度，根据前期试验结果分析，药材提取3次以上其药液浓度变化不明显，因此，从节约溶剂成本与提高药液浓度出发，选取提取次数为1、2、3次进行考察。根据正交试验结果的直观分析及方差分析，3种因素对柳茶总三萜提取的影响大小依次为：提取时间>料液比>提取次数，其中提取时间的影响具有统计学意义。

在3种因素中，提取时间的影响最大，笔者推测柳茶中三萜化合物的环状结构会随着提取时间的延长发生重排，结构改变会导致其有效成分被破坏。此外，料液比和提取次数为次要影响因素，这可能是在提取柳茶总三萜时，溶剂和提取次数改变对结果的影响较小。最终确定的工艺为：提取温度为80 ℃，加入20倍量70%乙醇，提取2次，每次1.5 h，柳茶总三萜含量可达32.25%。

大孔吸附树脂对天然药物成分的吸附具有一定选择性，最终可达到富集纯化的目的。为了能够制备符合要求的中药有效部位原料药，在确定提取工艺的基础上以柳茶总三萜含量为评价指标进行富集工艺的优化，最后确定的富集工艺为：AB-8型大孔吸附树脂湿法上柱，上样浓度为2 mg/mL，吸附2 h，以2 BV体积的蒸馏水冲洗，10%乙醇洗去杂质，再以5 BV的80%乙醇以2 BV/h速度洗脱，总三萜含量可达61.09%，将总三萜含量较提取物提高了0.9倍，其抗缺氧活性也提高了1倍，表明AB-8型树脂对柳茶总三萜的富集效果良好。

小鼠在缺氧条件下体内的能量代谢出现障碍，生理功能紊乱，表现为一些蛋白质如缺氧诱导因子-1α、血管內皮生长因子、Nrf2等代谢出现异常，产生自由基的蓄积，氧化应激系统障碍[17]，影响其各项生理活动且体内的自我调节系统紊乱以致死亡。常压密闭缺氧实验以小鼠存活时间延长率为指标，判断药物抗缺氧活性的优劣[18]。小鼠在常压密闭条件下产生过氧化应激，自由基大量堆积，使心肌受到严重损害[19]，最终导致小鼠死亡。实验结果表明，柳茶总三萜各剂量组均能不同程度地延长小鼠缺氧状态下的存活时间，抗缺氧作用显著，且柳茶总三萜的抗缺氧活性呈剂量依赖性。急性减压缺氧实验模拟高原低压缺氧环境，根据小鼠的存活率判断其抗急性缺氧能力的强弱，从而评定药效优劣。低压氧舱模拟10 000 m缺氧环境造成的缺氧模型实验表明，3种剂量均能使缺氧状态下小鼠的存活率提高，且柳茶总三萜高剂量组存活率最高。常压密闭缺氧实验及急性减压缺氧实验结果均表明，柳茶总三萜具有较强的抗缺氧活性，其抗缺氧活性呈剂量依赖性。但是其抗缺氧作用的机制还有待进一步研究。

本试验将评价药材提取富集工艺的理化指标（提取率、总三萜含量）与药效学指标（小鼠抗缺氧活性）综合进行评价，方法科学合理，重复性好，可以为进一步开发藏药柳茶提供依据。

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（收稿日期：2017-05-24）

（修回日期：2017-06-12；编辑：陈静）