血管生成因子AGGF1表达与结肠癌患者预后关系的研究*

方瑜洁　张明丽

西安市第一医院干五消化科(710002)

背景：血管生成在肿瘤生长和转移过程中起关键作用。AGGF1是一个新发现的血管生成因子，在多种恶性肿瘤中存在异常表达。目的：探讨AGGF1表达与结肠癌患者预后的关系。方法：收集西安市第一医院2010年1月—2012年12月80例结肠癌手术患者的癌组织和配对癌旁组织标本，以免疫组化法检测AGGF1表达。分析癌组织AGGF1表达与肿瘤临床病理特征和患者预后的关系，以Cox回归模型分析结肠癌患者的预后影响因素。结果：结肠癌组织AGGF1表达阳性率显著高于癌旁组织(67.5%对32.5%,P<0.05)，并与肿瘤分化程度、淋巴结转移、血管淋巴管浸润和TNM分期显著相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，AGGF1阴性表达结肠癌患者的生存率显著高于AGGF1阳性表达患者(P<0.05)。单因素和多因素分析表明，AGGF1与结肠癌患者预后显著相关(OR=2.09, 95% CI: 1.67～4.45, P=0.011; OR=1.98, 95% CI: 1.72～4.59, P=0.000)。结论：结肠癌组织中血管生成因子AGGF1表达显著升高，并与肿瘤转移和患者预后不良相关，是一个潜在的预后指标，值得进一步深入研究。

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，年新发病例数在全球恶性肿瘤中居第三位[1]。结肠癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段的过程，但是其具体机制尚不清楚。AGGF1(angiogenic factor with G-patch and FHA domains 1)基因于2004年首次被克隆、鉴定[2]，该基因高表达于血管内皮细胞，编码蛋白具有强烈的血管生成作用。研究发现AGGF1在多种恶性肿瘤中存在异常表达，可能参与了肿瘤演进过程中的多种病理过程，在肿瘤发生、发展中起重要作用，并与患者预后不良密切相关[3-6]。本研究通过分析80例结肠癌患者的AGGF1表达情况及其相关临床资料，旨在探讨AGGF1表达与结肠癌患者预后的关系。

材料与方法

一、一般资料

回顾性收集西安市第一医院2010年1月—2012年12月结肠癌手术患者80例。入选患者中男性47例，女性33例，年龄37～78岁，平均(57.2±6.3)岁，术前均未接受放化疗以及其他相关治疗；结肠癌诊断经术后病理检查证实，手术标本蜡块保存于病理科，临床病理资料和随访信息完整。研究方案经医院伦理委员会审核通过。

二、方法

1. 资料采集：通过查阅住院病史获取患者临床病理资料，电话和门诊随访生存信息，以手术时间为随访起点，截止至2017年12月。

2. AGGF1免疫组化染色：采用免疫组化SP法，主要试剂购自北京诺和生物技术有限公司。结肠癌组织和配对癌旁非癌组织病理切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；3% H2O2室温孵育10 min；柠檬酸钠缓冲液95 ℃加热10 min，室温放置30 min，PBS漂洗；10%羊血清室温孵育30 min；加入AGGF1抗体，4 ℃过夜；多次冲洗后加入生物素标记的兔二抗，室温孵育30 min；DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

AGGF1主要表达于细胞质，免疫阳性物质呈淡黄色至棕褐色。于200倍视野下计数不少于200个细胞，根据阳性细胞比例和染色强度进行免疫组化评分。阳性细胞比例：0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞<10%；2分，阳性细胞10%～50%；3分，阳性细胞>50%。 染色强度：0分，不着色；1分，淡黄色；2分，棕色；3分，棕褐色。总分为两项评分的乘积，≥1分判定为AGGF1表达阳性。由2名病理专科医师进行独立评分，评分不一致时由上级病理学专家确定最终评分。

三、统计学分析

结　　果

一、结肠癌组织AGGF1表达

免疫组化染色显示，80例结肠癌组织中54例AGGF1表达阳性，配对癌旁组织中26例AGGF1表达阳性，癌组织AGGF1表达阳性率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(67.5%对32.5%, χ2=19.600,P<0.001)(图1)。

A：AGGF1阳性表达；B：AGGF1阴性表达

二、AGGF1表达与结肠癌临床病理特征的相关性

统计学分析显示，结肠癌组织中的AGGF1表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、血管淋巴管浸润和TNM分期之间存在显著相关性(P<0.05)，与患者性别、年龄以及肿瘤大小和浸润深度无明显关联(P>0.05)(表1)。

三、AGGF1表达阳性与阴性结肠癌患者生存率比较

Kaplan-Meier生存曲线分析显示，AGGF1阴性表达结肠癌患者的生存率明显高于AGGF1阳性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

四、结肠癌患者预后影响因素的单因素和多因素分析

Cox回归模型单因素分析显示，肿瘤分化程度、淋巴结转移、血管淋巴管浸润、TNM分期和AGGF1表达与结肠癌患者的预后显著相关(P<0.05)(表2)；多因素分析中、上述因素亦均与预后显著相关(P<0.05)(表3)。

表1　AGGF1表达与结肠癌临床病理特征的相关性分析

图2AGGF1表达阳性与阴性结肠癌患者生存率比较(Kaplan-Meier生存曲线)

表2　结肠癌患者预后影响因素单因素分析(Cox回归模型)

表3　结肠癌患者预后影响因素多因素分析(Cox回归模型)

讨　　论

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤侵袭和转移力强，但肿瘤转移的确切机制尚不清楚。血管生成在肿瘤生长和转移过程中起关键作用，以肿瘤血管生成为靶点探索新的预后评估指标和新的治疗方案具有重要临床意义。AGGF1是一个新发现的血管生成因子，参与血管分化，启动血管生成和血管网络维护。在斑马鱼胚胎中，AGGF1被证实具有调控血管生成和分化、参与静脉建立的作用[7]。对肢体缺血小鼠模型的研究[8]亦表明，AGGF1能促进血管生成、增加血流量、抑制组织坏死。

研究发现AGGF1在多种恶性肿瘤中表达异常，但关于其在肿瘤发生、发展中的作用机制尚不完全清楚。本研究检测了80例结肠癌组织及其配对癌旁非癌组织中的AGGF1表达情况，发现癌组织AGGF1表达阳性率显著高于癌旁组织，与既往在食管鳞癌[3]、肝细胞癌[4-5]、胃癌[6]中的发现相一致。上述研究还发现，AGGF1高表达与患者生存率降低显著相关，是患者预后不良的独立危险因素。本研究进一步分析了结肠癌组织AGGF1表达与患者临床病理特征的关系，结果显示其表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、血管淋巴管浸润和TNM分期显著相关；Kaplan-Meier生存曲线分析表明AGGF1阴性表达患者的生存率显著高于AGGF1阳性表达患者；Cox回归模型单因素和多因素分析表明AGGF1是结肠癌患者的独立预后因素。提示AGGF1可能通过参与结肠癌肿瘤血管生成，参与肿瘤进展和转移。既往研究[3-5]证实，AGGF1表达与肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)表达和微血管密度呈显著正相关。关于AGGF1调控肿瘤血管生成的分子机制，目前尚不清楚。有研究发现β-连环蛋白(β-catenin)在结肠癌中参与VEGF的表达调控[9]；而AGGF1作为核染色质相关蛋白，参与了β-catenin介导的结肠癌细胞基因转录[10]。因此，通过β-catenin信号通路诱导VEGF表达可能是AGGF1参与调节结肠癌肿瘤血管生成的机制之一。

除参与肿瘤血管生成外，AGGF1表达异常尚可能通过其他机制参与恶性肿瘤的发生、发展。有研究[11]发现，AGGF1蛋白在高级别尿路上皮癌中的强阳性表达率明显低于低级别尿路上皮癌和正常尿路上皮组织，可能的原因是低氧在高级别尿路上皮癌中更为常见，AGGF1表达下调可能通过抑制低氧诱导的肿瘤细胞凋亡，对低氧环境中的肿瘤细胞发挥保护作用。其确切作用机制有待进一步深入研究。

综上所述，血管生成因子AGGF1在结肠癌组织中的表达显著升高，并与肿瘤转移和患者预后不良相关，是一个潜在的预后指标。本研究局限性主要在于样本量较小以及未评估AGGF1基因表达。后续研究拟完善上述不足，进一步探讨AGGF1参与结肠癌肿瘤血管生成的确切机制。