消毒剂对不同材料表面大肠埃希菌生物膜的灭菌效果

王亚洲，詹　峰

(苏州大学附属常州肿瘤医院，江苏常州 213000)

近年来，大肠埃希菌的分离率在住院患者感染的病原体中一直占首位，其中50%以上的大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，产ESBLs的大肠埃希菌株使得大肠埃希菌对药物的耐药率明显提高[1-5]。在自然环境中，约80%微生物以生物膜状态存在[6]。生物膜是微生物黏附于物体表面或组织，包含在自身分泌的保护性细胞外基质内的高度结构化的微生物群体，生物膜的结构可保护膜内的细菌抵抗各种环境压力，使细菌长期存活[7]。在医院内感染的发生过程中，65%与生物膜有关[8]。

本实验研究了大肠埃希菌ATCC25922在塑料、玻璃及不锈钢表面形成生物膜的能力，并比较了ATCC25922与本院分离于无菌体液的9株产ESBLs大肠埃希菌生物膜形成能力的差别，也对医院常用消毒剂对大肠埃希菌ATCC25922生物膜的灭菌功效进行了研究。

1　材料与方法

1.1标本来源标准菌株大肠埃希菌ATCC25922购自原卫生部临床检验中心，9株产ESBLs大肠埃希菌分离自2015年10月至2016年2月无菌体液标本，编号分别为25、26、30、38、45、54、58、59、68，-70 ℃保存于15%甘油肉汤。

1.2试剂与仪器结晶紫染液(贝索公司)，消毒剂中和剂(温州康泰)，过氧乙酸(上海哈勃)，戊二醛(江西汇康)，次氯酸钠(江苏爱物福)，乙醇(江西汇康)，碘伏(江西汇康)。BEPⅢ酶标仪(德国西门子)，96孔培养板(浙江拱东)。购买厚度为0.5 mm的塑料片、普通不锈钢片及玻璃片，用剪刀和玻璃刀切割制成4.0 mm×20.0 mm×0.5 mm的塑料片、玻璃片及普通不锈钢片，实验前经75%乙醇浸泡10 min。

1.3方法

1.3.1生物膜形成检测根据文献[9-10]所述方法，将分离的实验菌调为0.5麦氏单位的菌液，然后用胰蛋白胨大豆肉汤培养液稀释为106CFU/mL。实验根据材料分为塑料组、玻璃组和不锈钢组。将塑料片、玻璃片及不锈钢片置于试管内，分别吸2 mL上述菌液于试管内，35 ℃培养24 h，将塑料片、玻璃片及不锈钢片分别移至无菌试管内，生理盐水洗去游离的细菌，甲醇固定15 min，待干后加结晶紫染液染色10 min，洗去未结合的染液，待干后加入95%乙醇2 mL脱色10 min，吸100 μL到96孔板内，酶标仪570 nm测吸光度(A)值，比较各组吸光度的变化。不加菌液孔作为阴性对照，测定孔吸光度大于阴性对照孔吸光度为生物膜阳性[11]。

1.3.2消毒剂对生物膜的灭菌效果依上述方法将形成生物膜的塑料片、玻璃片及不锈钢片分别转移至无菌试管内，分别加入75%乙醇、有效氯500 mg/L消毒液、5%碘伏、0.2%过氧乙酸、2%新洁尔灭各2 mL，以不加消毒液管为对照管,各作用1、5、15、30、60 min后吸去消毒液，加入含有相应中和剂的营养肉汤2 mL，35 ℃培养12 h，转种到营养琼脂平板，35 ℃培养24 h观察有无细菌生长。

2　结　　果

2.1大肠埃希菌不同材料表面形成生物膜能力ATCC25922大肠埃希菌在塑料、玻璃及不锈钢的表面均可形成生物膜，在不锈钢表面形成生物膜的能力均强于塑料表面和玻璃表面(P<0.05)，见表1。

2.2产ESBLs大肠埃希菌在不同材料表面形成生物膜能力本研究的9株产ESBLs大肠埃希菌在塑料、玻璃及不锈钢表面均可形成生物膜，与ATCC25922差异无统计学意义(P>0.05)；各菌株在不锈钢表面形成生物膜的能力均强于塑料表面和玻璃表面,见表2。

表1　　ATCC25922大肠埃希菌在不同材料表面生物膜的形成能力(A值，

注：与塑料组相比，*P<0.05

表2　　产ESBLs大肠埃希菌在不同材料表面形成生物膜的能力(A值，

注:与不锈钢组相比，*P<0.05

2.3不同消毒剂对生物膜细菌的灭菌功效使用乙醇(75%)、有效氯(500 mg/L)、碘伏(5%)、过氧乙酸(0.2%)、新洁尔灭(2%)对不同材料表面生物膜分别作用1、5、15、30、60 min，发现乙醇(75%)、有效氯(500 mg/L)、过氧乙酸(0.2%)、新洁尔灭(2%)均可在1 min杀灭生物膜细菌；碘伏(5%)作用生物膜细菌1 min，仍有细菌存活，需要5 min方可杀灭生物膜细菌。

3　讨　　论

塑料、玻璃及不锈钢材料普遍存在于医院各种环境表面，细菌在医院环境中的各种物体表面形成生物膜，是住院患者潜在的感染源之一。本实验发现大肠埃希菌株ATCC25922及从临床分离的9株产ESBLs大肠埃希菌株均可在塑料、玻璃及不锈钢材料表面形成生物膜，且ATCC25922与产ESBLs大肠埃希菌无明显差异。大肠埃希菌在不锈钢材料表面形成生物膜的能力最强，玻璃材料次之。CREMET等[10]也发现金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在不锈钢材料上比聚乙烯材料更易形成生物膜，此现象与不锈钢表面光滑程度不如玻璃和塑料有关。尽管有研究报道生物膜内细菌的抵抗力比游离菌显著增高，但在本实验中，乙醇(75%)、有效氯(500 mg/L)、过氧乙酸(0.2%)、新洁尔灭(2%)可以在1 min杀灭生物膜内细菌，碘伏也可在5 min杀灭生物膜内细菌。因此，采用适宜的消毒剂和正确的消毒时间对环境表面消毒，便可降低感染的危险因素，预防、控制医院感染的发生。