益生菌抑制人结肠癌细胞SW-480细胞增殖的机制研究

陈　赞，林　朗，杨宗哨，李丕宏，陈上住

(1.苍南县人民医院 消化内科，浙江 温州 325800；2.温州医科大学附属第二医院 普外科，浙江 温州 325000)

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，全球结肠癌的发生率和死亡率位于恶性肿瘤的第三位[1-3]。细胞生长增殖失调是肿瘤发病的重要机制之一[4-5]，肠道微生物种群及宿主与微生物的相互作用可能是结肠癌发生另一重要机制[6]。研究发现[7-8]，嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌具有多种益生作用，如阻止致病菌定植、诱发肠道免疫、降低胆固醇、控制内毒素、制造营养物质、刺激组织发育等。本研究旨在探讨嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌与长双歧杆菌对结肠癌细胞增殖的影响及其分子机制。

1　材料和方法

1.1试剂和仪器益生菌菌种购自美国菌种保藏中心(ATCC)公司，胎牛血清、RPMI1640培养基购自Gibco公司，兔抗人Bax多克隆抗体、抗GAPDH抗体购自Abcam公司，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)购自Corning公司，垂直电泳仪、BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，qRT-PCR试剂盒购自Takara公司，PCR仪购自ABI公司。

1.2细胞株及细胞培养人结肠癌SW-480细胞购于美国ATCC公司，接种于含10%胎牛血清(含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)的改良型RPMI1640培养液，培养条件为37 ℃、5% CO2，细胞生长至对数生长期时进行研究。

1.3菌体成分制备将纯化并鉴定后的嗜酸乳杆菌(ATCC 4356)、乳双歧杆菌(CGMCC1.2226)和长双歧杆菌(ATCC 15708)接种于疱肉培养基(无水硫酸镁0.1 g，多胨12 g，磷酸氢二钠11 g，植胨3 g，酵母粉3 g，硫代硫酸钠1.0 g，可溶性淀粉3 g，牛肉渣1 g，pH 7.8，高压灭菌121 ℃，15 min)进行培养，达到足量的益生菌菌体浓度后通过超声破碎及高速低温离心，分离得到细菌细胞壁及细胞质成分。

1.4MTT法检测细胞增殖 RPMI1640 培养液重悬SW-480细胞，按细胞数密度为1×105个细胞/mL、每孔100 μL接种到96孔板。于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后分别加入益生菌活菌体、细胞壁和细胞质，采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量。益生菌活菌体细胞数与SW-480细胞数比例分别为 1∶1、10∶1、50∶1，益生菌细胞壁和细胞质的浓度分别为10、50、100、200 μg/mL。每组设置五个复孔，每组空白对照不加任何处理因素。采用MTT法检测细胞增殖，37 ℃培养48 h后加入5 mg/mL的MTT，继续培养6 h后弃去细胞上清液体，再向各孔中加入100 μL 二甲基亚砜(DMSO)震荡孵育10 min。用酶标仪在450 nm处测定吸光值，抑制率 =(1-实验组吸光值/空白对照吸光值)×100 %。

1.5实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Bcl-2表达将SW480细胞37 ℃恒温培养培养48 h后，利用Trizol法提取总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA第一链，参照试剂盒说明进行操作。通过qRT-PCR检测目的基因mRNA表达水平，以GAPDH作为内参，GAPDH上游引物5'-GACCCCTTCATTGACCTCAA-3'，下游引物5'-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'。Bcl-2上游引物5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’，下游引物5’- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’。每组实验重复3次，应用2-ΔΔCt方法计算Bcl-2的相对表达量。

1.6Western blot法检测Bax蛋白表达将SW480细胞接种于细胞培养瓶，37 ℃恒温培养培养48 h后，预冷PBS冲洗2次后加入100 μL的细胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制剂10 mg/mL)提取总蛋白，按常规方法进行Western blot实验操作，兔抗人的Bax多克隆抗体(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)稀释，以GAPDH为内参照，加化学发光剂显色，Bax蛋白表达情况通过Image J软件计算蛋白灰度进行量化。

1.7统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1益生菌菌体对SW-480细胞增殖的影响嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌与长双歧杆菌菌体分别与SW-480细胞共培养48 h，均抑制SW-480细胞增殖并呈现一定的浓度依赖性，见表1。

表1　益生菌菌体对人结肠癌

2.2益生菌细胞质与细胞壁成分对SW-480细胞的抑制作用10、50、100、200 μg/mL的益生菌细胞质和细胞壁成分分别作用于SW-480细胞48 h，分析对SW-480细胞抑制率计算各组半抑制浓度(IC50)值。三组益生菌细胞壁成分的抑制作用均大于细胞质成分，其中乳双歧杆菌细胞壁成分对SW-480细胞增殖抑制作用最强，见表2。

表2　益生菌成分作用

2.3益生菌细胞壁成分对SW-480细胞Bcl-2表达的影响三种益生菌的细胞壁成分处理SW-480细胞48 h，qRT-PCR结果显示，与空白对照(0.97±0.3)比较，嗜酸乳杆菌(0.71±0.4)、乳双歧杆菌(0.53±0.1)与长双歧杆菌(0.63±0.3)三组的Bcl-2相对表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

与空白对照比较，*P < 0.05；**P < 0.01图1　益生菌细胞壁成分对SW-480细胞Bcl-2表达的影响(48 h)

2.4益生菌细胞壁成分对SW-480细胞Bax表达的影响三种益生菌的细胞壁成分处理SW-480细胞48 h，与空白对照(0.52±0.11)比较，嗜酸乳杆菌(0.69±0.18)、乳双歧杆菌(0.81±0.10)与长双歧杆菌(0.73±0.12)三组的Bax表达均提高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

与空白对照比较，*P < 0.05图2　Western blot法检测益生菌细胞壁成分对SW-480细胞Bax表达的影响(48 h)

3　讨论

目前用于治疗结肠癌的临床药物种类繁多，然而这些药物都有不同程度的副作用[9]。因此，研发新型的结肠癌靶向治疗药物是近些年的关注重点。应用细菌治疗肿瘤具有悠久的历史[10]，但细菌毒性等因素限制了其研究与临床应用。随着相关益生菌研究技术的提高，为消化系统肿瘤治疗的研究提供了新思路[11]。益生菌已被建议作为一种新的预防和治疗结肠癌的选择。

益生菌具有改善肠道健康作用，是平衡菌群功能的微生态调节剂，也是一种取代平衡系统中的菌系作用的微生物添加物。研究表明[8]，益生菌有阻碍致病菌在肠道定植，诱导肠道免疫，降低胆固醇，制造营养物质，刺激组织发育等功能，可有效预防或抑制宿主结肠癌症的发生。益生菌提高人体的免疫机能、抑制肿瘤发生的机制已逐渐引起学者们的关注，摄入益生菌L.caseiZhang可通过Claudin15- CLIC4 信号途径预防结肠癌，实验动物模型研究显示，摄入保加利亚酸乳可以抑制结肠癌生长[12]；Jacouton等[13]研究发现，益生菌L.caseiBL23可通过上调caspase-7,caspase-9和Bik等机制显著减少氧化偶氮甲烷诱导的结肠癌小鼠模型中的肿瘤形成，提示该益生菌有望成为抗结肠癌生物制品。本研究MTT增殖实验结果显示，嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌与长双歧杆菌可抑制结肠癌细胞增殖并呈现浓度依赖性，进一步证实了益生菌可抑制结肠癌生长。为了解益生菌细胞壁和细胞质抗结肠癌能力，本研究分离益生菌的细胞壁和细胞质分别作用于结肠癌细胞，结果发现，三组益生菌细胞壁和细胞质均有抑制结肠癌细胞增殖的作用，并且细胞壁的抑制作用均大于细胞质。

结肠癌的发病机制复杂，细胞增殖失控是肿瘤发生的初始阶段。益生菌可通过线粒体途径调控结肠癌细胞凋亡，抑制增殖。Russo 等[14]研究发现Lactobacillusrhamnosus菌株细胞质可以通过调节Bax/Bcl-2 mRNA表达，显著抑制人胃癌细胞HGC-27增殖并促进其凋亡。本研究进一步观察了嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌与长双歧杆菌的细胞壁成分对结肠癌细胞Bcl-2表达水平及Bax表达水平的影响，结果显示，三种益生菌细胞壁均可抑制Bcl-2表达，提高Bax表达水平，提示嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌与长双歧杆菌可能通过线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡。

综上所述，嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌三种益生菌均可抑制SW-480细胞增殖，其机制可能与Bcl-2表达下调、Bax表达上调有关。