4个苹果品种的AFLP分子标记研究

王晓英,郭廷松,王新花*,殷红燕,李 慧,杨 波,高 红,边晓惠,孔风芹

1.泰安市泰山林业科学研究院,山东 泰安 271000

2.泰安市徂徕山林场,山东 泰安 271000

3.泰安市林业局,山东 泰安 271000

4.肥城市潮泉镇,山东 泰安 271000

元帅系苹果的果实大，高桩，果面浓红，色泽艳丽，果皮厚，肉质松脆，酸甜适口，芳香浓郁；幼树树势强健，盛果期树势易衰弱，枝条粗壮，易形成短果枝，结果早，丰产，而果实耐贮藏性较差，果实容易软化变绵[1]。不同元帅系品种在枝条、贮藏性等性状间存在较大差异[2-6]，DNA分子标记是现代分子生物学发展出来的一类重要的遗传标记，已广泛应用于遗传图谱的构建、种质资源的管理和鉴定、基因的定位与克隆等，目前应用于苹果种质资源研究的分子标记主要是RAPD、SSR、SRAP、AFLP[7-20]，相对而言，AFLP标记能够提供的信息量更大，多态检出率更高，且稳定性好，重复性强[21,22]，而AFLP分子标记应用较少[18-20]。本试验以不同元帅系苹果品种为研究材料，利用AFLP技术进行遗传分析，通过对基因组DNA的限制性酶切片段进行选择性扩增而揭示特有基因，从基因水平直接反映品种间差异，突破传统方法的局限性，为新品种选育和鉴定提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试苹果品种共4个(表1)：(1)红星；(2)泰山红星，是红星变异品种，泰山林场栽植，经多年栽培观察，其生长势强，果实可在室温下自然放置2～3个月，到春节食用，比红星苹果的贮藏时间长；(3)沂蒙短枝红星；(4)授粉品种金冠，均由泰安市泰山林业科学研究院苹果种质资源圃提供。

表1 苹果品种名称Table 1 Apple variety name

1.2 操作步骤

1.2.1 基因组DNA提取 用改良CTAB法提取苹果基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 限制性酶切及连接 0.5 mL离心管中加入20 μL反应体系（DNA模板4 μL，Adapter 1 μL，PstI/MseI 2 μL，10×NEB buffer 2.5 μL，10m mol/LATP 2.5 μL，5 U/μL T4 Ligase 1 μL，H2O 7 μL），混匀离心数秒，37℃保温5 h，8℃保温4 h，4℃过夜。PstI接头1:5′＞CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA＜3′，MseI接头1:5′＞GAC GAT GAG TCC TGA G＜3′；PstI接头2:5′＞ TGTACG CAG TCTAC＜3′；MseI接头2:5′＞TAC TCA GGA CTC AT＜3′。

1.2.3 预扩增 25 μL 反应体系（模板 DNA 2 μL，10 mmol/L 预扩引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，2 U/μLTaq酶 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL）离心数秒，进行 PCR 扩增 94 ℃ 2 min，30轮循环（94℃30 s，56℃30 s，72℃80 s），72℃5 min，将预扩增产物4℃保存备用。

1.2.4 选择性扩增 预扩产物稀释后作为选扩模板，按25 μL体系（模板DNA2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，1 mmol/L dNTP 0.5 μL，1 mmol/LPstI引物 1 μL，1 mmol/LMseI引物 1 μL，2 U/μL Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 17.5 μL）混匀后，离心数秒，进行PCR循环，第一轮扩增参数：94℃30 s，65℃30 s，72℃80 s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。接着按94℃30 s，55℃30 s，72℃80 s扩增23轮，延伸加时，72℃5 min。

1.2.5 凝胶分析 选择性扩增产物和上样缓冲液比例为8:3，涡旋混匀，95℃变性，8 min后，立即冰浴，取4 μL上样到ABI 377测序仪，进行4%聚丙烯酰胺凝胶电泳，自动采集原始胶图。对照(Marker)为 ROX500分子量内标。电泳结束后用Genescan3.1从原始胶图中提取数据，然后用Binthere将片段的大小提取出来，再用Excel将数据转换成0和1数据，用Ntsys2.10进行聚类分析。用Max comp程序对聚类结果和相似系数矩阵之间的相关性进行Mantel检验。

2 结果与分析

2.1 引物筛选和多态性分析

通过对64对AFLP引物的筛选，筛选出了12对多态性较强且扩增产物清晰的引物组合(表2)。

表2 12对AFLP引物标记条带数统计Table 2 12 pairs of band numbers of AFLP primer markers statistics

12对引物共扩增条带826条，其中多态性带595条；平均1对引物扩增条带69条，多态性带50条，多态百分比为72.0%。12对引物组合均能揭示DNA多态性，其中引物Pst I GAC/Mse I CTA扩增出多态性条带最少为31条，多态性比例最小为55.4%，Pst I GAT/Mse I CAT扩增的多态性带为68条，多态性比例最高为93.2%。

2.2 凝胶分析

利用筛选得到的12对引物对4个苹果品种的基因组DNA进行扩增，AFLP扩增产物长度介于70～500 bp之间，结果条带清晰。4个苹果品种经其中6对引物扩增的电泳图谱见图1。

图1 6对引物的扩增结果Fig.1 Amplification results of 6 pairs of primers（6对引物：Pst I GAA/Mse I CAA、Pst I GAG/Mse I CAC、Pst I GAG/Mse I CAG、Pst I GAC/Mse I CAT、Pst I GAT/Mse I CAA、Pst I GAT/Mse I CAT）

2.3 品种的多态性分析

泰山红星苹果共扩增出558个条带，其中多态性条带351条，显著多于其他3个种质，多态性比率最高，为62.9%，含有102条特有带；沂蒙短枝红星和红星扩增出条带分别为517、497条，多态性条带分别为310、290条，特有带分别为64和55条。金冠共扩增出380个条带，多态性条带173条，多态比例最低，为45.5%，其特有带为59条（表3）。

表3 4个苹果品种多态性分析Table 3 Genetic diversity analysis of 4 varieties of apple

2.4 遗传相似系数分析

4个品种间遗传相似系数变化范围为0.5846～0.7515，红星、泰山红星和沂蒙短枝红星间遗传相似系数较高，其中红星和沂蒙短枝红星间遗传相似系数最高为0.7515。金冠与其他供试品种的遗传相似系数都较小，说明其间遗传距离较远（表4）。

表4 4个苹果种质的遗传相似系数Table 4 Genetic similarity coefficients of 4 varieties of four apple germplasm

2.5 聚类分析

基于AFLP的扩增结果，用NTSYS2·10进行UPGMA聚类分析，得到4个苹果种质的亲缘关系树状图(图2)。将聚类结果进行Mantel检验，相关系数为0.802，达到极显著水平，表明聚类结果很好地体现了4个苹果品种间的亲缘关系。从聚类结果图可以看出，AFLP标记可将供试的4个品种完全区分开。

基于AFLP技术进行聚类分析，在遗传相似系数阂值0.65处作切割线，将4个品种分为2类。第I为金冠，第Ⅱ类由3个品种组成，分别为红星、泰山红星和沂蒙短枝红星，三者亲缘关系较近，遗传相似系数范围为0.7050～0.7515。

图2 4个苹果品种的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMAdendrograms of four apple cultivars

3 结论与讨论

祝军等[22]用AFLP分子标记的PstI/MseI体系的4对引物在25个品种中共扩增出了224条不同分子量DNA带，4对引物共发现多态性位点122个，占55.0%，平均每条引物扩增56条不同分子量DNA带，本研究采用AFLP分子标记的PstI/MseI体系筛选出了12对多态性较强且扩增产物清晰的引物组合，在4个苹果品种中共扩增出826条DNA片段，其中多态性条带为595条，多态性位点所占比例为72.0%，平均每条引物扩增69条不同分子量DNA带，扩增DNA带和多态性位点比例显著提高，因此本AFLP分子标记技术体系可应用于苹果遗传多样性与品种鉴定。

苹果分布较广，基因组杂合度高，在长期的自然演化和种间杂交过程中，形成了生态适应性差异较大、数量庞大的变异新种和新的无性系，进行传统的遗传育种费时、费力且费用较高，近年来DNA分子标记技术在苹果上的发展和应用，成为苹果遗传育种研究的重要方法和辅助育种手段[23]。本研究利用AFLP分子标记技术对3个元帅系苹果品种的DNA标记结果表明，泰山红星、沂蒙短枝红星和红星扩增出条带分别为558、517、497条，其中多态性条带分别为351、310、290条，说明3个元帅系苹果品种的遗传物质存在差异，需对其遗传规律进行深入研究。

[1]李林光.山东省苹果品种发展及高效育种思考[J].落叶果树,2016,48(2):1-3

[2]田凤娟.元帅系短枝型品种枝组连续结果能力研究[D].兰州:甘肃农业大学,2015

[3]杨有龙.美国元帅系苹果品种(系)介绍[J].北方果树,1987(Z1):84-88

[4]史燕山,骆建霞,刘玉冬.苹果元帅系品种过氧化物酶同工酶酶谱的比较[J].落叶果树,1995(3):14-15

[5]苹果育种组.元帅系苹果芽变新品种果实经济性状比较分析[J].落叶果树,1991(3):18-23

[6]牛自勉,王贤萍,许月明,等.元帅系苹果贮藏期间芳香物质的含量变化[J].华北农学报,1997,12(1):87-91

[7]王彩虹,束怀瑞.利用分子标记研究苹果资源与基因组的进展[J].果树学报,2001,18(2):104-109

[8]李汝刚.分子标记在苹果品种鉴定中的应用[J].生物技术通报,1997(1):17-21

[9]何晓薇,王彩虹,田义轲,等.苹果果皮颜色性状的SSR标记[J].果树学报,2009,16(3):379-381

[10]于华平,房经贵,张美勇,等.RAPD标记用于葡萄、苹果等7种果树的品种鉴定的研究[J].江西农业学报,2009,21(10):5-9

[11]巴巧瑞,赵政阳,高 华,等.基于SSR和SRAP标记的苹果品种亲缘关系分析[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2011(9):123-128

[12]蔡 青,姜立杰,张晓明,等.苹果主栽品种的SSR分子标记鉴别[J].中国农学通报,2007,23(7):129-134

[13]赵 静,田义轲,王彩虹,等.与苹果果皮红色性状相关的RAPD分子标记的筛选[J].果树学报,2006,23(2):165-168

[14]周志钦,李育农,王力超.11种野生苹果种质资源RAPD标记研究[J].西南农业大学学报,1998(1):36-39

[15]何 平,李林光,李慧峰,等.S-SAP分子标记开发及其在苹果芽变鉴别上的应用[J].植物遗传资源学报,2013,14(2):298-302

[16]刘孟军.RAPD标记在苹果属种间杂交一代的分离方式[J].园艺学报,1998,25(3):214-219

[17]王刚刚,王 飞,赵政阳,等.苹果果实酸/低酸性状的SSR标记[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2010,38(6):132-137,144

[18]石丽雪,沙广利,王 斌,等.苹果性状标记AFLP技术体系的建立和优化[J].山东农业科学,2006(2):15-20

[19]韩 蕾,徐继忠,李振侠,等.利用AFLP分子标记鉴定苹果砧木[J].华北农学报,2008,23(6):171-175

[20]祝 军,王 涛,赵玉军,等.应用AFLP分子标记鉴定苹果品种[J].园艺学报,2000,27(2):102-106

[21]Zabeau M,Vos P.Selective restriction fragment amplification,a method for DNA fingerprinting[P].European Patent Application 94202629.7(publication No.05348AI).Paris:European Patent Office,1993

[22]Vos P,Hogers R,Bleeker M,et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Research,1995,23(21):4407-4414

[23]李英慧,韩振海,许雪峰.分子标记技术在苹果育种中的应用[J].生物技术通报,2002(6):11-13,10