miR181b影响ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化形成的自噬调节机制

董轶　杨绍南　潘旭东　马爱军　李舒　裴浩天

[摘要]目的

探讨微小RNA 181b（miR181b）是否通过调节自噬相关靶蛋白参与动脉粥样硬化发展。

方法

通过颈总动脉套环诱导ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成。通过尾静脉注射miR181b慢病毒载体构建其过表达（miR181bOE）及低表达（miR181bKD）模型。检测血浆中脂质水平，苏木精伊红染色对动脉粥样硬化斑块大小和体积进行定量，Western Blot检测自噬相关蛋白的表达。

結果各组ApoE-/-小鼠血浆中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平均无显著差异（P>0.05）。MiR181bKD和miR181bOE分别显著减少和增加颈动脉斑块面积和体积（F=118.95～322.03，P<0.05）。MiR181bOE可下调微管相关蛋白1轻链3膜结合型（LC3Ⅱ）的表达，上调核糖体蛋白质S6激酶类70kDa（p70S6K）表达，抑制自噬体形成；相反，miR181bKD可上调LC3Ⅱ的表达，下调p70S6K表达，促进自噬体形成。差异均有显著性（F=107.38～398.13，P<0.05）。

结论抑制miR181b可能通过下调p70S6K表达增加自噬活性，延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成。

[关键词]动脉粥样硬化；微RNAs；自噬体；核糖体蛋白质S6激酶类，70kDa

[中图分类号]R743.1；R543.5

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02014406

动脉粥样硬化已经成为威胁人类健康的最危险的疾病之一，颈动脉是多发部位[12]。颈动脉狭窄是缺血性卒中的危险因素，可导致高达10%～20%的卒中或短暂性脑缺血发作[3]。研究认为，动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，其起始和发展与大动脉和中动脉内膜中的胆固醇积累有关[4]。但是，目前动脉粥样硬化的病理生理机制还不完全清楚，新的治疗方法和生物标志物都需进一步阐明。自噬是一种高度保守过程，细胞质内的物质均可通过溶酶体依赖途径降解[56]。最近的证据表明，动脉粥样硬化斑块中的自噬标志物的表达可在低密度脂蛋白、炎症和代谢应激等内在刺激下被相应上调。值得注意的是，前期研究表明自噬也会被其他信号因子调控。其中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）被认为在自噬诱导的负性调节中发挥重要作用[5，7]。核糖体

蛋白质S6激酶类70kDa（p70S6K）作为mTOR主要下游效应物，参与了细胞生长、细胞存活和凋亡相关分子mRNA翻译过程[89]。自噬活性与mTOR/p70S6k信号通路密切相关[1011]。文献报道，微小RNA 320a（miR320a）、miR155、miR143/145和miR92a与动脉粥样硬化斑块形成关系密切[1217]。miR181b的表达水平在经肿瘤坏死因子α（TNFα）处理或喂食高脂肪饮食的小鼠主动脉内膜中下调。脂质体包裹miR181b靶向基因转染可以模拟ApoE-/-小鼠，抑制核因子κB（NFκB）活化，NFκB反应性促炎基因表达、白细胞积聚和动脉粥样硬化病变形成[1824]。目前还不清楚miR181b是否可以通过mTOR信号通路调节自噬活性。本研究的目的是通过miR181b过表达和低表达来研究动脉粥样硬化斑块和自噬的相关性。

1材料和方法

1.1动物与试剂

1.1.1动物及分组取雄性6周龄的ApoE-/-小鼠40只（C57BL/6小鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司），喂饲高脂肪饮食（含质量分数为0.002 5的胆固醇和0.150 0的脂肪，北京华阜康生物科技股份有限公司）。所有小鼠饲养在青岛大学中心实验室内，室温为22～24 ℃，明暗照明周期为12 h12 h，动物自由饮食。ApoE-/-小鼠在手术和整个实验开始前2周开始高脂肪饮食。按照文献报道的方法[2526]，在高脂肪饮食喂养后2周颈总动脉套环诱导斑块形成。在病变发展的8周过程中，小鼠每周3次经尾静脉注射生理盐水（对照）或miR181b慢病毒载体。小鼠在8周龄随机被分为4组（每组10只），分别是对照组（A组，高脂饮食+假手术+10 μL生理盐水）、模型组（B组，高脂饮食+手术+10 μL生理盐水）、miR181b过表达组（OE组（C组），高脂饮食+手术+10 μL miR181bLV， 每只鼠滴定至2×107 TU）和miR181b低表达组（KD组（D组），高脂饮食+手术+10 μL miR181bRNAiLV，每只鼠滴定至2×107 TU）。动物实验的所有执行程序均按照ARRIVE指南。

1.1.2试剂及来源蛋白质提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），抗p70S6K抗体（Cell Signaling，2708），抗pp70S6K抗体（abcam，ab131436），抗LC3Ⅱ（abcam，ab48394），抗GAPDH（北京康为世纪生物科技有限公司），miR181bshRNA的慢病毒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2测试指标与方法

1.2.1血脂分析8周后处死小鼠并从股动脉处采血，离心后收集血清。通过日本希森美康XS500i全自动血液分析仪分别检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的含量。

1.2.2组织学和透射电子显微镜检查颈动脉用40 g/L多聚甲醛固定12 h，用于石蜡包埋。颈动脉石蜡切片用苏木精伊红（HE）染色观察形态学变化。选取从颈动脉近心端至远端连续切片中的5个视野进行分析。电镜样品先用30 g/L戊二醛固定，然后固定于10 g/L四氧化锇中，在二甲胂酸钠缓冲液中洗涤，用梯度乙醇脱水，再置换为环氧丙烷，并应用Epon812环氧树脂包埋。切成半薄片（1 μm）用亚甲基蓝染色，然后用光镜（Olympus，日本）定位观察。超薄切片用柠檬酸铅盐和乙酸双氧铀染色，最后在JEM1400电子显微镜（JEOL，日本）下观察。采用EM相机特征图像系统（830.10U3 CCD Gatan，美国）拍摄透射电镜图像。

1.2.3蛋白免疫印迹将颈动脉保存在液氮中并储存在-80 ℃冰箱中。样品被均质化，蛋白质通过RIPA裂解缓冲液提取，蛋白质浓度通过BCA法定量。将等量蛋白质（20 μg）上样，并通过150 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE电泳）。然后，将蛋白转移并固定到聚偏二氟乙烯膜上（PVDF膜，Millipore，美国）。使用体积分数0.05的脱脂牛奶将膜在室温下封闭2 h，然后在4 ℃下用一抗（1∶1 000）孵育过夜。次日，将膜与相应辣根过氧化物酶（HRP）標记的二抗（1∶5 000）（北京康为世纪生物科技有限公司）在室温下孵育1 h。采用GE Image Quant LAS 4000mini超灵敏化学发光成像仪显影，并用Image Pro Plus软件对吸光度进行测定。以管家蛋白GAPDH（上海碧云天生物科技有限公司）作为内参蛋白。

1.3统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件进行处理。计量数据用[AKx-D]±s形式表示，多组之间的比较用单因素方差分析法（ANOVA）进行分析，多重比较采用LSD、SNK、Tukey等方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1miR181b对小鼠血浆脂质水平的影响与对照组相比较，模型组、miR181bOE组以及2.2MiR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块形成影响

与模型组相比较，miR181bKD组中斑块最大狭窄部位面积和斑块体积显著减小（F=118.95～302.43，P<0.05）。相反，与模型组相比较，miR181bOE组斑块面积和体积显著增加（F=122.10～322.03，P<0.05）。因此，miR181b基因过表达促进模型小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成，而miR181b基因敲除抑制斑块形成。见图1和表2。

2.3MiR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块中自噬体形成影响

透射电镜观察结果表明，对照组动脉粥样硬化斑块中无自噬空泡聚集，可见少量脂滴；而模型组动脉粥样硬化斑块中自噬空泡和脂滴较对照组增多；miR181bOE组小鼠动脉粥样硬化斑块中自噬体较模型组显著减少；而miR181bKD组动脉粥样硬化斑块中自噬体显著高于模型组，而且可见大量自噬溶酶体。见图2。以上结果提示，miR181b可能通过自噬途径影响小鼠动脉粥样硬化的形成。

2.4MiR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块中LC3Ⅱ蛋白表达影响

蛋白印迹检测结果显示，与模型组相比，miR181bKD组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平显著增加，而miR181bOE组LC3Ⅱ表达被抑制（F=107.38～376.53，P<0.05），表明miR181b低表达可增强自噬活性，而其高表达抑制自噬活性。见图3。

2.5miR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块中pp70S6K和p70S6K蛋白表达影响

与模型组相比较，miR181bOE组小鼠的pp70S6K/p70S6K明显升高，但miR181bKD组的pp70S6K/p70S6K明显降低，差异均有统计学意义

（F=117.33～398.13，P<0.05）。表明miR181b可能激活mTOR信号通路并导致自噬抑制。见图4。

3讨论

本研究采用ApoE-/-小鼠颈动脉套管术和高脂饮食建立动脉粥样硬化动物模型，结果显示，下调miR181b可以抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成，而过表达可促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成。在miR181bOE组LC3Ⅱ表达下调、p70S6K表达上调、自噬被抑制，而miR181bKD组LC3Ⅱ表达上调、p70S6K表达下调、自噬增强。抑制miR181b表达可能通过抑制p70S6K表达增强自噬，延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成。

miRNA是一组长度19～25 bp、高度保守的非编码小RNA，通过碱基互补或部分碱基互补与靶基因mRNA结合，降解mRNA或抑制其翻译，在转录后水平调节基因表达。近年来的研究结果表明，miRNAs在动脉粥样硬化斑块进展中发挥重要作用[13]；miR155在ApoE-/-小鼠主动脉中表达上调，敲除miR155可抑制动脉粥样硬化斑块形成。miR143/145在调控血管平滑肌细胞表型转换中发挥重要作用。研究还发现，Ldlr-/-小鼠敲除miR143/145后动脉粥样硬化斑块体积显著减小[14]。既往的研究表明，促炎刺激和高脂肪饮食可抑制小鼠主动脉组织中miR181b表达[21]。同时，炎症疾病病人循环miR181水平有所下降，包括脓毒症和冠状动脉疾病[21，24]。然而，没有研究直接评估miR181b水平在动脉粥样硬化过程中的作用。本研究中，通过在ApoE-/-小鼠尾静脉中注射miR181b慢病毒载体构建miR181b过表达和低表达模型，并进一步评价其生物学功能。与模型组比较，miR181bOE组颈动脉斑块面积和体积明显增高，相反，miR181bKD组斑块形成明显减轻。因此，我们的研究结果表明，miR181b过表达加重动脉粥样硬化斑块形成，而miR181b下调则延迟动脉粥样硬化斑块的进展。

自噬是一种用以维持细胞基础代谢稳定的自我平衡机制，是一种依赖细胞自身溶酶体的降解途径。近年来发现，自噬与动脉粥样硬化的进展关系密切。据报道，动脉粥样硬化早期自噬即可活化，以保护巨噬细胞免受氧化损伤，以及对过量蛋白质和受损细胞器进行降解[27]。在巨噬泡沫细胞中，自噬参与将胆固醇和脂肪滴转运到溶酶体中去[2728]。因此，本研究为调节动脉粥样硬化斑块的稳定性和治疗动脉粥样硬化病人的新方法提供了有用的提示。虽然我们的研究结果表明，模型组颈动脉斑块中的自噬被激活，但与对照相比其展现出较严重的动脉粥样硬化。有学者认为，自噬的激活不能在严重的脑血管损伤和氧化应激条件下吞没受损的线粒体细胞器[29]。其更有可能激活内源性凋亡细胞，导致动脉粥样硬化进展期间细胞器损伤或蛋白质聚集。也有学者认为，缺乏自噬相关基因可以降低巨噬细胞应对内源性凋亡作用和应激的能力，从而导致动脉粥样硬化斑块坏死[28]。因此，我们推测动脉粥样硬化进展期间mTOR信号传导抑制涉及各种危险因素，并可促成自噬激活。即自噬失活不能延缓动脉粥样硬化斑块形成的进展。

LC3是自噬活性的标志蛋白，主要有LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、LC3Ⅲ等3个亚型，其中LC3Ⅱ常作为自噬标志性物质。有文献报道，自噬在动脉粥样硬化早期阶段被激活，以保护巨噬细胞免受氧化损伤，并降解过量的蛋白质和受损的细胞器[27]。并且越来越多的证据表明，miRNAs在动脉粥样硬化进展中可调节自噬相关蛋白表达，如miR126、146a、155等[1517]。本研究显示，miR181bOE组小鼠颈动脉斑块中自噬体形成减少，LC3Ⅱ表达水平下调；相反，miR181bKD组自噬体形成增多，LC3Ⅱ表达水平也上调。说明miR181b过表达可能通过抑制自噬加速动脉粥样硬化斑块进展，而miR181b下调则通过激活自噬延缓斑块进展。

mTOR作为生长因子、能量和营养状态的感受器，可通过调节下游自噬复合物的形成，直接调控细胞自噬。p70S6K作为mTOR的主要下游效应物，mTOR的激活导致p70S6K的磷酸化，最终增强了与细胞生长、细胞存活和凋亡相关分子mRNA翻译和蛋白质表达。研究结果表明，miRNA122通过mTOR/p70S6k信号通路可调控靶基因胰岛素样生长因子受体1的功能[29]。miRNA223抑制细胞增殖的作用也是通过其下游信号通路mTOR/p70S6k而实现的[30]。因此，mTOR/p70S6k信号转导通路可作为miRNAs发挥其调控作用的机制之一。同时，自噬活性与mTOR/p70S6k信号通路也密切相关。但是，miRNAs能否通过mTOR/p70S6k通路影响自噬过程报道较少。本研究结果表明，miR181bOE組斑块中pp70S6K/总p70S6K表达比例显著上调，而miR181bKD组其比值显著降低，提示miR181b可能通过mTOR/p70S6k信号通路调节自噬进而影响动脉粥样硬化过程。

综上所述，miR181b可通过正性调节mTOR信号通路的下游分子p70S6K的表达，而负性调节自噬，进而促进了动脉粥样硬化斑块的形成。然而，miR181b调控mTOR信号通路的具体分子机制还需要进一步研究探索。

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