高效液相色谱法检测食品中Nisin的方法研究

朱明扬，余莲芳，黄谦，高炜

（岳阳市食品质量安全监督检验中心，湖南岳阳 414000）

Nisin是乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)的一种多肽产物，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500 u[1]。它是一种世界公认的、无害的天然食品防腐剂和抗菌剂。目前已超过60个国家批注允许使用，包括欧盟、英国、美国和中国等[2]。我国食品安全最新颁布的《食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)中，Nisin批准用于乳制品、酱制品和熟肉制品（包括熟制水产品）等领域，并规定其使用限量。然而GB 1886.231-2016仅为现行乳酸链球菌素检验的产品标准，2017年1月1日实施，却未有关于Nisin作为一种食品添加剂的分析检测方法标准。

目前国内外关于Nisin的检测方法主要包括琼脂扩散法[3]、生物荧光法[4]、电泳法[5]、比浊法[6]和免疫吸附法[7,8]等。随着近年高效液相色谱仪和气相色谱仪在科研院所和检测单位的普及，仪器分析取代化学分析和生物分析的标准越来越多，方便了大批次情况下的检测工作。关于HPLC检测Nisin的相关报道，如高彩红等[2]采用HPLC检测发酵食品中Nisin的含量，分别对固体和液体样品前处理，在紫外检测波长 220 nm下，梯度洗脱70 min，结果表明线性关系、回收率和相对标准偏差良好；黄谦和高炜等[9]以辣蒜酱为研究对象，HPLC评价了Nisin的溶解度、稳定性和生物利用度；同时优化了食品中 Nisin的提取条件，以乙腈和稀盐酸(pH=2)为提取溶剂，经超声和水浴处理，梯度洗脱 34 min，结果表明回收率为 92.54%，RSD＜3%；Efstathios等[6]研究比较了HPLC和浊度法定性定量检测乳酸链球菌素，采用有机溶剂沉淀、离子交换色谱和固相萃取净化处理样品，梯度洗脱 44 min，并用外标法对吸收光谱分析和精确定量，得出高效液相色谱法灵敏度和准确度比浊度分析法高。

一些学者也对Nisin净化处理过程进行了研究，如Borzenkov等[10]对比了疏水性膜、离子交换和疏水色谱法净化处理方式，结果表明色谱法净化效果明显；有学者也分析了净化处理乳酸菌细菌素的关键问题，并提出净化效率的改善过程。因此，Nisin的检测较多局限在产量、方法比对及纯化，而少有关于作为添加剂针对食品的检测方法，且关于我国食品安全标准中Nisin检测的研究非常少。

本文以14种食品为研究对象，系统地对食品分类提取、优化色谱条件，进而确定一种易操作、回收率高、精确度高、稳定性好、重复性好、检出限低的HPLC检测方法。这既提高了食品中 Nisin的安全性控制，降低了食品安全隐患，同时也对建立检测食品中Nisin的高效液相色谱法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

依照《食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)，收集乳制品、酱制品和熟肉制品（包括熟制水产品、以鱼制品为重点）共三类14种食品（见表1），均在市场上购买。

其中熟肉制品的酱汁鱿鱼、鸭小腿、九卤酱辣脖已在市场流通的产品中，标注添加乳酸链球菌素作为防腐剂。

表1 样品收集Table 1 Sample collection

乳酸链球菌素标准品(纯度 98%以上，生物试剂900 IU/mg)，源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱级)，Sigma-Aldrich上海贸易有限公司；三氟乙酸(分析纯)，天津市光复精细化工研究所；浓盐酸(分析纯)，株洲市星空化玻有限责任公司。

Agilent 1100高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；WH-2微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；H1850R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

Smart 2 Pure超纯水机，赛默飞世尔科技有限公司；PHS-3C pH计，上海精科有限公司；KQ-600E数控超声波清洗器和 KQ-700DE电子恒温不锈钢水浴锅，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸链球菌素标准贮备液制备(20mg/mL)

称取1.0 g(精确至0.00001 g)标准品于50 mL容量瓶中，加稀盐酸(pH=2)定容，4 ℃冰箱保存，有效期1个月。

1.2.2 乳制品、酱制品和熟肉制品提取液制备

称取搅拌均匀样品20g(精确至0.0001 g)于50 mL离心管中，加入乙腈和稀盐酸，稀盐酸百分比分别为100%、80%、60%、40%、20%、0%（当稀盐酸百分比为60%时，先加入6 mL乙腈，再加入9 mL的稀盐酸(pH=2)），共 15 mL(熟肉制品 25 mL)，于 2000 r/min下高速振荡混匀，30 ℃超声20 min，再50 ℃下水浴40 min，4 ℃ 10000 r/min离心20 min。取下层提取液过0.22 μm滤膜，测定Nisin含量[9]。做三个平行，以标品为对照，提取液中的Nisin含量以回收率表示，公式如式（1）。

其中X为Nisin含量的回收率(%)；m1为加标量(IU)；m2为检测量(IU)。

1.2.3 标准曲线的绘制

准确吸取标准储备液12.5 mL置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配置成浓度为5 mg/mL标准工作液。再准确吸取标准工作液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL至10 mL容量瓶中。其乳酸链球菌素标准溶液的最终效价分别为 180 IU/mL、360 IU/mL、540 IU/mL、720 IU/mL、900 IU/mL、1800 IU/mL、2700 IU/mL、3600 IU/mL、4500 IU/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样，以效价为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 色谱条件

参考黄谦等[9]、Efstathios等[6]报道的高效液相色谱法，略作修改后对Nisin含量进行高效液相色谱法检测。通过对比标准物质的保留时间和光谱以及添加标准物质到样品中判定可疑峰，并制作标准曲线，采用外标法进行定量。

色谱条件：色谱柱，TC-18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相，0.1%三氟乙酸和 10%乙腈的水溶液(A)、0.07%三氟乙酸和90%乙腈的水溶液(B)；梯度洗脱程序如表2；流速为1.2 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为10 µL；检测波长为220 nm。

表2 流动相洗脱程序Table 2 Gradient elution program

1.2.5 精密度试验

取样品提取液，连续进样6针测定[11]。

1.2.6 稳定性试验

取样品提取液6份，分别在4 ℃下保存0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h 后测定[11]。

1.2.7 重复性试验

样品提取液各制备6份待测定[11]。

1.2.8 检出限

取样品提取液，进样测定，分析色谱图并计算信燥比和检出限[11]。

2 结果与分析

2.1 乳制品中Nisin提取的回收率

图1 提取溶剂对R-3中Nisin回收率的影响Fig.1 The effect of solvent extraction on the recovery rate of Nisin in R-3

图2 稀盐酸百分比为60%时，乳制品中Nisin的回收率Fig.2 The recovery rate of Nisin in dairy products in the percentage of diluted hydrochloric acid is 60%

图3 R-1 1800 IU/mL提取液色谱图Fig.3 Chromatogram of R-11800 IU/mL extract liquid

由图1可知，以R-3为研究对象，相同的Nisin添加量，在稀盐酸百分比分别为100%、80%、60%、40%、20%、0%的溶剂提取下表现出极显著的差异(p＜0.01)。其中，当稀盐酸百分比为 60%时，回收率最高为90.40%，随着提取溶剂稀盐酸百分比增加或减少，回收率均下降。当提取溶剂稀盐酸百分比减少到20%时，Nisin未检出。龚东磊[12]等研究了Nisin对活性益生菌乳饮料的抑菌性，结果表明少量的 Nisin添加量，可以显著性地延长产品的酸化变质。

以乳制品R-1、R-2、R-3、R-4、R-5为研究对象，相同的Nisin添加量，加入6 mL乙腈、再加入9 mL的稀盐酸(pH=2)作为提取溶剂的回收率，如图2所示。其中，R-5回收率最高为98.69%，R-1回收率次之为93.79%，再依次是 R-3、R-4、R-2，回收率均在86%～100%之间。样品色谱图如图3所示，在5～12 min内均实现了基线分离，且分型尖锐明显。

2.2 酱制品中Nisin提取的回收率

图4 提取溶剂对J-1中Nisin回收率的影响Fig.4 The effect of solvent extraction on the recovery rate of Nisin in J-1

由图4可知，以J-1为研究对象，相同的Nisin添加量，在稀盐酸百分比分别为100%、80%、60%、40%、20%、0%的溶剂提取下表现出极显著的差异(p＜0.01)。

其中，当稀盐酸百分比为40%时，回收率最高为93.51%，随着提取溶剂稀盐酸百分比增加或减少，回收率均下降。当提取溶剂稀盐酸百分比减少到0%时，Nisin未检出。

图5 稀盐酸为40%时，酱制品中Nisin的回收率Fig.5 The recovery rate of Nisin in sauce products with the percentage of diluted hydrochloric acid of 40%

图6 J-1 1800IU/mL提取液色谱图Fig.6 Chromatogram of J-11800 IU/mL extract liquid

王莉嫦[13]等研究了Nisin在鸡汁鲍鱼罐头中的应用，正交试验优化得到Nisin浓度为300 mg/kg时，产品口感好，成本低。Hsieh[14]等研究了Nisin在豆浆、大蒜中的协同作用，结果表明抑制李斯特菌作用增强。

以酱制品J-1、J-2、J-3为研究对象，相同的Nisin添加量，加入9 mL乙腈、再加入6 mL的稀盐酸(pH=2)作为提取溶剂的回收率，如图5所示。其中，J-1回收率最高为93.04%，J-2回收率次之为87.49%，最低的是J-3为85.91%。样品色谱图如图6所示，在5～9 min内均实现了基线分离，且分型尖锐明显。

2.3 熟肉制品中Nisin提取的回收率

图7 提取溶剂对SR-3中Nisin回收率的影响Fig.7 The effect of solvent extraction on the recovery rate of Nisin in SR-3

由图7可知，以SR-3为研究对象，相同的Nisin添加量，在稀盐酸/乙腈百分比分别为 100%、80%、60%、40%、20%、0%的溶剂提取下表现出极显著的差异(p＜0.01)。其中，当稀盐酸/乙腈百分比为60%时，回收率最高为104.5%，随着提取溶剂稀盐酸百分比增加或减少，回收率均下降。当提取溶剂稀盐酸百分比减少到20%时，Nisin未检出。

贾晓云[15]、Fernanda[16]和温斯颖[17]等分别研究了鲜肉、熟肉和火腿中Nisin的抗菌作用，结果表明菌的数量急剧降低。

图8 稀盐酸为60%时，熟肉制品中Nisin的回收率Fig.8 The recovery rate of Nisin in cooked meat product with the percentage of diluted hydrochloric acid of 60%

图9 SR-1 1800 IU/mL提取液色谱图Fig.9 Chromatogram of SR-11800 IU/mL extract liquid

以熟肉制品 SR-1、SR-2、SR-3、SR-4、SR-5、SR-6为研究对象，相同的Nisin添加量，加入10 mL乙腈、再加入15 mL的稀盐酸(pH=2)作为提取溶剂的回收率，如图 8所示。其中，SR-3回收率最高为101.34%，SR-5回收率次之为99.72%，再依次是SR-6、SR-2、SR-4、SR-1，回收率均在79%～100%之间。样品色谱图如图9所示，在5～12 min内均实现了基线分离，且分型尖锐明显。

2.4 标准曲线的绘制

图10 220 nm标准曲线(a)和光谱图(b)Fig.10 220 nm standard curve (a) and spectrogram (b)

由图10a可知，180 IU/mL、360 IU/mL、540 IU/mL、720 IU/mL、1800 IU/mL、2700 IU/mL、4500 IU/mL共7个不同浓度的标准溶液制作标准曲线。结果表明：以效价为横坐标，以峰面积为纵坐标，线性关系为Y=0.114X-5.725，r=0.99992。图10b为乳酸链球菌素目标峰的光谱图，最大吸收波长为220 nm。图11为1800 IU/mL标液在吸收波长为220 nm下的色谱图。

图11 标液（1800 IU/mL）色谱图Fig.11 Chromatogram of standard liquid (1800 IU/mL)

2.5 高效液相色谱法的精密度、稳定性、重复性、检出限试验

由表3可知，以R-3、J-1、SR-3为研究对象，采用1.2.4高效液相色谱条件分别对其精密度、稳定性、重复性、检出限试验。

表3 R-3、J-1、SR-3样品高效液相色谱法的精密度、稳定性、重复性和检出限试验Table 3 The precision, stability, repeatability and detection limit test of HPLC in R-3, J-1 and SR-3

6 7.66 515.8 7.69(96 h) 159.2 7.61 192.0 RSD/% 0 1.00 0.37 7.65 0.32 2.05酱制品 900 IU/mL J-1 J-1 J-1 1 7.87 89.5 7.81(0 h) 184.6 7.81 184.6 2 7.87 91.0 7.84(6 h) 183.9 7.79 188.9 3 7.87 92.2 7.90(12 h) 183.8 7.80 176.8 4 7.87 88.8 7.74(24 h) 180.9 7.81 182.9 5 7.87 89.7 7.74(48 h) 177.1 7.79 177.1 6 7.87 91.9 7.68(96 h) 170.3 7.78 186.3 RSD/% 0 1.53 1.03 3.08 0.15 2.69熟肉制品(包括熟制水产品) 1800 IU/mL SR-3 SR-3 SR-3 1 7.3 198.9 7.21(0 h) 201.4 7.20 201.4 5.80 205 IU/mL 2 7.32 202.1 7.26(6 h) 199.2 7.19 210.8 3 7.32 197.4 7.20(12 h) 196.6 7.18 192.6 4 7.32 204.0 7.19(24 h) 191.0 7.19 198.2 5 7.32 200.5 7.08(48 h) 182.3 7.20 200.0 6 7.32 199.3 7.17(96 h) 164.9 7.19 186.7 RSD/% 0 1.19 0.83 9.37 0.10 4.13 5.67 198 IU/mL

表4 高效液相色谱法检测14种食品中Nisin的试验结果Table 4 The results of Nisin in 14 foods detected by HPLC

结果表明：精密度保留时间的RSD均为0，峰面积的RSD均小于1.6%，精密度高；稳定性保留时间的RSD均小于1.1%，峰面积的RSD以J-1为最低，稳定性较好；重复性保留时间的RSD均小于0.4%，峰面积的RSD以R-3为最低，重复性好，其次J-1；检出限以R-3最低为194 IU/mL，J-1和SR-3分别是205 IU/mL、198 IU/mL；表4为14种食品中Nisin的试验结果。

3 结论

3.1 乳制品、酱制品和熟肉制品中乳酸链球菌素提取表明：稀盐酸百分比分别为60%、40%和60%，经超声、水浴、离心，得到的回收率分别为90.40%、93.51%和104.50%。

3.2 高效液相色谱法得出：TC-18色谱柱(4.6 mm×250mm，5 μm)；流动相，0.1%三氟乙酸和10%乙腈的水溶液(A)、0.07%三氟乙酸和90%乙腈的水溶液(B)；梯度洗脱16 min；检测波长为220 nm。以R-3、J-1、SR-3为研究对象，该方法分别对其精密度、稳定性、重复性、检出限试验，结果表明：保留时间的RSD均小于1.1%；精密度高；稳定性以J-1为最佳；重复性以R-3为最佳，其次J-1；检出限以R-3最低为194 IU/mL，J-1和SR-3分别是205 IU/mL、198 IU/mL。