2型糖尿病周围神经病变患者外周血CD4+调节性T细胞与25-（OH）D3的关系及其意义*

秦宏超，张真稳

（扬州大学临床医学院 内分泌科，江苏 扬州 225100）

糖尿病（diabetes mellitus, DM）周围神经病变（diabetic peripheral neuropathies, DPN） 是DM主 要的慢性并发症之一。≥50%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者合并有DPN，≥1/3的DPN患者存在针刺、烧灼及电击等疼痛症状[1]，严重影响患者正常的工作和生活，也是DM晚期致死、致残的主要原因之一。T2DM及其并发症的发病机制涉及多方面，免疫机制也参与其中。由于疾病病因和长期病程，患者免疫功能多受到影响，细胞免疫平衡被破坏，其中T淋巴细胞亚群的变化尤为显著。调节性T细胞（T-regulatory cell, Tregs）是一类具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，在维持机体的免疫稳态和控制自身免疫病的进展方面具有重要作用[2]。维生素D（vitamin D, VD）除作为钙、磷代谢调节剂参与骨代谢外，还具有免疫调节作用（包括调节Tregs各个亚群比例、促进CD4+T分化及上调Tregs活性等）。血清25-羟维生素D3[25-（OH）D3]在DPN患者的糖代谢、营养神经、氧化应激及免疫调节方面均发挥作用[3-5]，与DPN具有相关性[6]。本文旨在探讨DPN患者25-（OH）D3和CD4+Tregs的关系及其意义，为DPN的发生机制和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月-2017年7月该院就诊的T2DM患者42例。其中，男性26例，女性16例；病程1～40年，平均10.5年；年龄35～86岁，平均（60.36±12.22）岁。所有患者均符合1999年世界卫生组织的DM诊断标准。排除标准：①非DM因素导致的神经病变（如腰椎病变、VB12缺乏及格林-巴利综合征等）、甲状腺功能亢进症及恶性肿瘤等；②合并有DM高渗昏迷、低血糖及DM酮症酸中毒等急性并发症；③合并有各类急性或慢性感染；④有骨质疏松和其他骨代谢异常疾病病史；⑤肝肾功能障碍、心功能不全及甲状旁腺疾病；⑥半年内使用过甲状旁腺激素、降钙素、类固醇激素、VD制剂及性激素等药物。

1.2 方法

1.2.1 一般资料采集 记录每位患者性别、年龄、DM病程等一般数据，测量身高、体重，计算体重指数（body mass index, BMI）。

1.2.2 实验室检查 所有受试者空腹≥8 h，于次日清晨抽取静脉血，采用AU2700型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）测定TG、TC、HDL-C、LDL-C、Scr、BUM及尿微量白蛋白（urine microalbuminuria,UMA）；采用糖化血红蛋白测定仪（美国Bia-rad公司）对HbA1c水平进行测定。

1.2.3 VD3水平测定及分类 抽取所有受试对象空腹静脉血，采用25-（OH）D3试剂盒（英国IDS公司）用酶联免疫吸附测定法测定。依据25-（OH）D3的水平：≤50 nmol/L为VD3缺乏；50～75 nmol/L为VD3不足；≥75 nmol/L为VD3充足[7]。

1.2.4 CD4+Tregs检测 使用PF-anti-CD25/FITC-anti-CD4荧光标记抗体（美国Serotec公司）标记两组分离好的单个核细胞样本，采用流式细胞仪（美国BD公司）进行Tregs检测，采用CXP Cytometer（美国贝克曼库尔特公司）对数据进行收集和分析。

1.2.5 DPN诊断 对受试者使用肌电诱发仪（日本光电工业株式会社）进行肌电图检查。确诊DPN标准[8]：在明确诊断DM同时或之后出现神经病变，临床表现与DPN表现（麻木、疼痛及感觉异常等）相符；5项检查（温度觉、足部感觉、踝反射、振动觉及神经传导速度）≥2项为异常。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）或中位数（四分位数）表示，比较用t检验，不满足或用轶和检验，相关分析采用Pearson法或Spearman法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组年龄、25-（OH）D3水平及Tregs百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组 BMI、HbA1c、UMA、BUM、Scr及血脂分析等比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 两组外周血25-（OH）D3水平和Tregs百分比的比较

两组外周血25-（OH）D3水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），DPN组外周血25-（OH）D3水平比非DPN组更低（P＜0.05）；两组外周血Tregs百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05），DPN组外周血Tregs百分比非DPN组更低（P＜0.05）。见表1和附图。

2.3 DPN组外周血Tregs百分比与各临床指标相关性分析

DPN组外周血Tregs百分比与25-（OH）D3呈正相关（P＜0.05），与年龄、BMI、HbA1c、UMA、BUM、Scr、TC、TG、HDL-C、LDL-C 无相关性（P＞0.05）。见表2。

附图 两组Tregs百分比的比较

表2 DPN组外周血Tregs百分比与临床指标相关性

3 讨论

近年来，Tregs作为维持机体免疫耐受的一个重要调控者备受关注。研究显示，T2DM外周血淋巴细胞的数量和比例以及相关炎症因子的改变，支持CD4+、CD25+Tregs参与DM微血管病变过程。杨雪等[9]研究发现，DPN患者外周血中CD4+、CD25+Foxp3+Tregs数量减少，可能是导致DPN患者神经组织自身免疫性损伤的原因之一。但DPN发病过程中Tregs所起作用进行的深入研究仍然较少。

VD作为一种脂溶性维生素，主要通过与其受体结合，调控基因转录，进一步发挥其生物学作用。VD在体内的主要存在形式为血清25-（OH）D3，是目前评价VD营养状况最有效指标[10]。多项研究表明，T2DM中VD缺乏与DPN相关，且VD缺乏可作为DPN发病的危险因子[11-12]。SHEHAB等[13]给57例VD缺乏DPN患者补充外源性VD后发现，VD能有效缓解DPN患者的临床症状，使疼痛评分得到改善。充足的VD还可降低中老年人罹患T2DM的风险[14-15]。而低于人群VD水平中位数的T2DM患者，5年后发生微血管并发症的概率增高[16]。VD对DPN的影响机制还不明确，研究证实VD可通过影响微血管功能、抑制炎症反应因子及直接保护作用对外周神经发挥作用[17-21]。笔者早期研究结果显示，T2DM DPN与VD水平有关[22]，本研究也证实DPN组25-（OH）D3水平较对照组降低，DPN患者普遍存在VD缺乏现象，进一步证实25-（OH）D3或参与DPN发生、发展。

近期研究表明，VD除经典的钙磷调节功能外，还在免疫调节中发挥重要作用，其主要的靶细胞（包括T淋巴细胞、树突状细胞及巨噬细胞等）抗原递呈细胞。VD可抑制T淋巴细胞的增殖、介导T细胞的凋亡并且改变Th1与Th2细胞之间的比例[23]。有研究表明，25-（OH）D3和转化生长因子β的联合刺激下，可增加FoxP3+调节性T细胞的表达，同时促进原始CD4+T细胞向Tregs分化[24]，此结论在URRY等[25]体外实验中也得到证实。PRIETL等[26]临床研究指出，在血清25-（OH）D3充足的正常对照组的外周血淋巴细胞中，Tregs所占比例增高，两者呈正相关。王琦等[27]在动物实验中发现，VD能刺激Tregs分泌的抑制性细胞因子产生白细胞介素10，从而发挥生物学作用。

综上所述，本研究结果支持DPN患者外周血CD4+Tregs与 25-（OH）D3水平相关。25-（OH）D3可通过影响DPN患者Tregs表达而影响DPN的发生、发展，为进一步揭示DPN发病机制提供新方向，VD或成为未来治疗DPN的一个新靶点，其能否通过补充外源性VD来调节T细胞的免疫功能，进而改变DPN进程，则需要更多的临床实验进一步证实。