蔬菜枯萎病镰刀菌种类研究

刘一景

（山西省植物保护植物检疫总站，山西太原　030000）

蔬菜是人们生活中不可或缺的食物，目前我国蔬菜种植面积约2000万hm2。枯萎病是影响蔬菜生产最主要的病害之一[1]。特别是由于保护地的特殊环境条件和长期连作，土壤中的病原菌量积累越来越多，使枯萎病之类的土传病害发生逐年加重[2]。镰刀菌(Fusarium)是引起枯萎病的病原菌，广泛分布于自然界中，可侵害多种农作物[3]。镰刀菌是植物维管束系统的寄生菌，在适宜的环境条件下，不但破坏作物的输导组织维管束，而且在菌体生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，严重时影响产量和品质[4]。

由于镰刀菌对人类的生产生活影响极大，许多科学家不断地对镰刀菌的形态、生理、致病性等多方面进行研究。因镰刀菌形态复杂，又易受到营养和外界环境影响而发生变异，所以给镰刀菌的分类鉴定造成了一定的困难，同时也给科学家提出了挑战，引起了人们的关注[5,6]。在我国，从谷类粮食、蔬菜中检测出镰刀菌的现象屡有报道，但对其有效防治和准确的鉴定还有欠缺，对镰刀菌种的研究还有待进一步的加强。因此，研究和明确一个地区的镰刀菌种类，对于检疫、病害防治、资源利用是一项基础性工作，具有重要的意义。本次研究对主要蔬菜枯萎病镰刀菌种类进行鉴定，了解镰刀菌种类资源状况，丰富真菌资源，为由镰刀菌引起的枯萎病的研究与防治提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1供试菌株。镰刀菌（Fusarium）菌株根据来源不同作物分别标记为，黄瓜（Fc01、Fc02、Fc03、Fc04、Fc05、Fc06、Fc07、Fc08），西瓜（Fw09），茄子（Fe10、Fe11），番茄（Ft12），油菜（Fr13）。

1.1.2供试培养基。PDA培养基，PSA培养基，Bilai’s培养基，米饭培养基。

1.2　试验方法

1.2.1培养性状试验方法。①菌株的活化：从储存的菌株中挑取菌丝，转接到PDA培养基上于25℃条件下培养5d。②菌落生长速度测定：PSA培养基上接菌，每皿2块，重复2次，于25℃下培养4d后，测量菌落直径，并取其平均值。③菌落质地及颜色测定：观察转接到PSA培养基上培养1周后的菌落质地，即气生菌丝是否茂盛，是否为棉絮状、羊毛状、绒状或毡状等，菌丝颜色，基物表面颜色，基物颜色（培养基有无变色，菌株有无分泌色素）。在Bilai’s培养基上接菌的方法同PSA培养基，培养条件相同，1周后观察菌落颜色,是否疏松。米饭培养基上每试管接入2块菌，重复4次，25℃条件下恒温培养20 d后，观察颜色。

1.2.2形态特征试验方法。①分生孢子特征的测定：待PSA培养基上的菌株培养2周后，制作临时玻片。在显微镜10×40倍数下进行检测。分别观察小型分生孢子和大型分生孢子的数量状况、形状、着生方式、有无分隔及分隔数，大、小型分生孢子各随机选取30个，测量其长和宽，最后进行显微摄影并记录。②产孢细胞特征的测定：判断产孢细胞是属于单瓶梗还是复瓶梗，并且观察其长度，最后进行显微摄影。

1.2.3综合鉴定方法。根据上述的培养性状和形态特征测定结果按 Booth （1971）、Nelson（1983）、Brayford（1993）和 Leslie（2006）的分类系统,结合《常见镰刀菌鉴定指南》对镰刀菌菌株进行形态学鉴定[7]。首先利用镰刀菌组和种的检索表，初步查出供试菌株的分类地位，再和同一组中相类似的种类进行相对应项目的比较，最后根据综合性状鉴定出所得菌株的种名。

2　结果与分析

2.1　研究结果

2.1.1菌株Fc01。①培养性状：平均生长速度为4.3cm。在PSA培养基上气生菌丝棉絮状，最初白色，后变浅驼色，基物表面浅黄色至驼色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。在米饭培养基上呈黄色（B）。②形态特征：小型分生孢子多，椭圆形、肾形、瓜子形等，0～2隔，大小为 5.8～20μm×2.8～4μm（C）。大型分生孢子纺锤形，或稍弯成镰刀状，2～6隔，多数3隔，大小为 15～44.2μm×3～6μm（D）。产孢细胞复瓶梗，较长（E）（图1）。

图1　菌株Fc01形态学特性

2.1.2菌株Fc02。①培养性状：平均生长速度为3.9cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，米色、黄色、棕红，基物表面棕红、浅黄色，基物不变色，可形成桔黄色分生孢子座（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。米饭培养基上粉红色（B）。②形态特征：小型分生孢子多,卵形、椭圆形、肾形、纺锤形等，大小为6.2～17.3μm×1.8～4.3μm（C）。大型分生孢子哑铃形、纺锤形，或稍弯成镰刀状，大小为 16～34.7μm×2.4～6.5μm（D）。产孢细胞单瓶梗和复瓶梗均有，较短（E）（图2）。

图2　菌株Fc02形态学特性

2.1.3菌株Fc03。①培养性状：平均生长速度为4.2cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色、粉白色，基物表面粉红，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝少，白色。在米饭培养基上呈粉红色（B）。②形态特征：小型分生孢子数量多，卵圆形或椭圆形，大小为5.2～12.3μm×2.8～4.6μm（C）。大型分生孢子月牙形，稍弯，多数 3隔，大小为 11.2～40μm×2.8～5.4μm（D）。产孢细胞单瓶梗，短（E）（图3）。

图3　菌株Fc03形态学特性

2.1.4菌株Fc04。①培养性状：平均生长速度为3.9cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色、粉白色、深红棕色，基物表面深红棕色、浅黄色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝少，白色。在米饭培养基上呈粉红色（B）。②形态特征：小型分生孢子数量多，卵圆形、肾形或椭圆形，大小为 5～10.7μm×2.4～3.4μm（C）。大型分生孢子美丽形、月牙形，稍弯，向两端比较均匀的逐渐变尖，多数 3隔，大小为 12～41μm×2.7～4.5μm（D）。产孢细胞单瓶梗，短（E）（图4）。

图4　菌株Fc04形态学特性

2.1.5菌株Fc05。①培养性状：平均生长速度为3.8cm。在PSA培养基上气生菌丝棉絮状，培养初期白色至粉色，后变浅驼色，可长橘黄色分生孢子座，基物表面橙黄色至淡褐色，基物不变色（A）。Bilai’s培养基上气生菌丝少，白色。米饭培养基上为浅咖啡色(B)。②形态特征：小型分生孢子极少。大型分生孢子镰刀形，弯曲，3～7 隔，多数 3～5 隔，大小为 16.5～42μm×3～6μm（C、D）。产孢细胞单瓶梗，较长（E）（图5）。

图5　菌株Fc05形态学特性

2.1.6菌株Fc06。①培养性状：平均生长速度为3.9cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，米色、黄色、棕红色，基物表面紫红色，浅黄色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。米饭培养基上淡黄至紫色（B）。②形态特征：小型分生孢子多，卵形、椭圆形、肾形等，串生和假头生并存，大小为4.4～20μm×2.1～3.7μm（C）。大型分生孢子纺锤形，或稍弯成镰刀状，大小为 16.8～33.7μm×3.1～6.7μm（D）。产孢细胞单瓶梗（E）（图6）。

图6　菌株Fc06形态学特性

2.1.7菌株Fc07。①培养性状：平均生长速度为3.7cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色、粉白色，基物表面粉红色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝少，白色。在米饭培养基上呈粉红色（B）。②形态特征：小型分生孢子数量多,卵圆形或肾形，大小为6.2～12.4μm×2.8～4.4μm（C）。大型分生孢子美丽形，月牙形，稍弯，大小为 15～47.2μm×3～4.7μm（D）。产孢细胞单瓶梗，短（E）（图7）。

图7　菌株Fc07形态学特性

图8　菌株Fc08形态学特性

2.1.8菌株Fc08。①培养性状：平均生长速度为3.8cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色，有黄色分生孢子座，基物表面橙色、浅黄色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。米饭培养基上咖啡色（B）。②形态特征：小型分生孢子多,卵形、肾形，大小为7.1～15.5μm×3.1～4.2μm（C）。大型分生孢子马特形，顶胞稍尖，大小为 15.1～35.2μm×3.3～6.4μm（D）。产孢细胞单瓶梗，长短不一（E）（图8）。

2.1.9菌株Fw09。①培养性状：平均生长速度为3.7cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色、粉白色，基物表面粉红色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝少，白色。在米饭培养基上呈粉红色（B）。②形态特征：小型分生孢子数量多,卵圆形或椭圆形，大小为6.8～12.3μm×2.4～4.1μm（C）。大型分生孢子美丽形，月牙形，稍弯，向两端比较均匀地逐渐变尖，多数3隔，大小为 11.9～42μm×2.6～4.7μm（D）。产孢细胞单瓶梗，短（E）（图9）。

图9　菌株Fw09形态学特性

2.1.10菌株Fe10。①培养性状：平均生长速度为3.4cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色、粉白色，基物表面粉红色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。在米饭培养基上呈粉红色（B）。②形态特征：小型分生孢子数量多，卵圆形或椭圆形，大小为 5.7～10.4μm×2～3.3μm （C）。大型分生孢子美丽形、镰刀形，向两端比较均匀地逐渐变尖，多数3隔，大小为 10.4～45.6μm×2.2～3.7μm（D）。产孢细胞单瓶梗，较短（E）（图10）。

图10　菌株Fe10形态学特性

2.1.11菌株Fe11。①培养性状：平均生长速度为3.2cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，白色至浅灰色，基物表面肉色、浅棕色，基物不变色（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。在米饭培养基上黄色至淡咖啡色（B）。②形态特征：小型分生孢子多,卵形、椭圆形等，大小为 8.6～15.6μm×2.6～3.5μm（C）。大型分生孢子马特形，两端较钝，大小为 11.7～35.5μm×3.3～4.2μm（D）。产孢细胞单瓶梗（E）（图11）。

图11　菌株Fe11形态学特性

2.1.12菌株Ft12。①培养性状：平均生长速度为3.3cm。在PSA培养基上气生菌丝棉絮状，白色至浅灰色，基物表面浅肉色至紫色，基物不变色,兼有黄色分生孢子座（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀少，白色。在米饭培养基上呈黄色至淡咖啡色（B）。②形态特征：小型分生孢子多，卵形、椭圆形等，大小为4.5～16μm×1.5～4μm（C）。大型分生孢子较胖，马特形，大小为14.1～34.2μm×3.7～5.5μm（D）。产孢细胞单瓶梗，少分枝，长短不一（E）（图12）。

图12　菌株Ft12形态学特性

2.1.13菌株Fr13。①培养性状：平均生长速度为4.2cm。在PSA培养基上气生菌丝绒状，米色、黄色，基物表面橙色，浅黄色，基物不变色，可形成桔黄色分生孢子座（A）。在Bilai’s培养基上菌丝稀疏，白色。在米饭培养基上黄色（B）。②形态特征：小型分生孢子多,卵形、椭圆形等，假头状着生，大小为5.6～19.4μm×2.4～4μm（C）。大型分生孢子纺锤形，大小为11～34μm×2.8～5.5μm（D）。产孢细胞单瓶梗（E）（图13）。

图13　菌株Fr13形态学特性

2.2　分析

根据以上测得的结果，利用镰刀菌检索表，初步得出菌株Fc01为直孢组（Arthrosporiella section），菌株Fc02、Fc06、Fr13 为李瑟组（Liseola section），菌株 Fc05为膨孢组（Gibbosum section）, 菌株 Fc03、Fc04、Fc07、Fw09、Fe10为美丽组（Elegans section），菌株 Fc08、Fe11、Ft12为马特组（Martiella section）。

通过种间特征对比，以及与标准形态图对比，综合得出最终鉴定结果(表1)：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）5株,茄病镰刀菌（Fusarium solani）3株，胶孢镰刀菌（Fusarium subglutinans）)2株，拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）1株，木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）1株，串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）1 株。

3　讨论

3.1　菌的致病性

从鉴定的结果可以看出：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）占供试总菌株的38%，其次是茄病镰刀菌（Fusarium solani）为23%和胶孢镰刀菌（Fusarium subg-lutinans）为15%，其余鉴定所得3种菌种类型则均为8%。虽然本研究未做镰刀菌的致病性测定,但根据镰刀菌鉴定结果和已有文献报道[8]，说明尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）对蔬菜的侵染能力强，特别是黄瓜和茄子，表明尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是蔬菜枯萎病的主要致病菌，其次是茄病镰刀菌（Fusarium solani）和胶孢镰刀菌（Fusarium subglutinans）。镰刀菌有许多是腐生菌，所以很多植物的枯萎病可能受到一种或几种镰刀菌和其他病原菌的侵染，可以引起单独侵染或复合侵染[9]。因此需要广泛采集样本来明确致病菌种类和优势种。本次研究的供试菌株只来源于4个种植区的5种蔬菜，共13株，不能完全代表蔬菜枯萎病镰刀菌的所有种类，因此还有待后续研究更多样本。

表1　主要蔬菜枯萎病镰刀菌鉴定结果

3.2　致病菌的产生及防治

鉴定结果表明，不同的蔬菜上菌种类型可能不同，也可能相同，同一种蔬菜上菌种类型也可能不同，说明镰刀菌种类与植物生理特征和植物生存环境有一定关系，尤其是小种专化型菌种。对于适合尖孢镰刀菌的形成和繁殖的地区，可推荐其防治措施有：轮作，但要考虑轮作时间和植物的种类，不宜与寄主植物轮作，一般以水旱轮作比较好；合理选地整地，清理病株残体，减少土壤湿度，抑制镰刀菌生长发育，蔬菜收获后要及时耕翻土壤，将残株深埋于土中，加快病残体的腐烂和防止子囊壳的形成；选育抗病品种；利用菌根真菌进行生物防治；植物检疫，有许多种镰刀菌病害,如菜豆、洋葱、大豆、菠菜等的枯萎病，国内尚无报道，必须严格执行检疫，防止危险性病害蔓延[10]。

3.3　培养基类型与菌株生长的关系

在镰刀菌的培养中,我们发现在PSA培养基上镰刀菌菌落明显，容易观察菌落特征，但部分镰刀菌不易产生大型分生孢子或产孢数量少，给镰刀菌的鉴定带来很大困难。黄文芳曾提到不同培养基上，菌丝生长速度和密度不同[11]。一些在PSA培养基和米饭培养基上只产生小型分生孢子的菌株，在Bilai’s培养基上却可以产生大型分生孢子。因此认为，不同培养基对镰刀菌营养生长和生殖生长有一定的影响，一般是营养丰富的培养基有利于营养生长，而营养贫乏的培养基有利于生殖生长。