生防菌玫烟色棒束孢IF-1106对梨小食心虫杀虫活性的测定

韩志慧，邢培翔，刁红亮，胡军，田晶，马瑞燕*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；3.吕梁学院 生命科学系，山西 离石 033000)

梨小食心虫Grapholithamolesta(Busck)，简称“梨小”，属鳞翅目(Lepidoptera)，卷蛾科(Tortricidae)，是世界性的主要蛀果类害虫之一[1]。梨小食心虫寄主植物包括蔷薇科的多种果树[2,3]，如桃、梨、苹果、李、杏、海棠、杨梅、山楂、枇杷等。该虫具有个体小、危害隐蔽、栖境多样、世代重叠、转寄主危害等特点，因此其预测、预报和防治较为困难[4,5]。

果园防治梨小食心虫的主要措施是喷洒化学杀虫剂和果实套袋[6]。过量施用化学农药污染环境，极易产生抗药性,危及食品安全，而果树套袋人工成本巨大，影响果业可持续健康发展。随着人们环保和食品安全意识的提高，生物防治逐渐引起人们的关注，如天敌防治[7]、性信息素防治[8]、病原微生物防治等，其中病原微生物防治害虫具有持效期长、安全高效、不伤害天敌、不易产生抗性等特点，可以有效地克服化学农药防治带来的不良后果[9]。目前，应用病原微生物对梨小食心虫进行防治的报道不多，能见到的主要是苏云金杆菌(Bt)和白僵菌[10]。

玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea)，属于半知菌亚门(Deuteromycotian)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Moniliales)丛梗孢科(Moniliaceae)棒束孢属(Isaria)，是一种重要的昆虫病原真菌。玫烟色棒束孢寄主范围广，包括同翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等8目[11]，能侵染烟粉虱[12]、桃蚜[13]、小菜蛾[14]、菜青虫[15]、柑橘木虱[16]等40多种昆虫，是生物防治重要的杀虫真菌之一。山西农业大学农学院生物安全与生物防治研究组筛选出1株潜力生防菌株，保藏登记名称为玫烟色棒束孢IF-1106。前期研究表明，该菌株对烟粉虱和桃蚜具有较高致病力。经孢子悬浮液(1×107孢子·mL-1)处理的烟粉虱2龄若虫7 d后累计校正死亡率达83.05%[12]；经高浓度孢子悬浮液(1×108孢子·mL-1)处理桃蚜后累计死亡率达91.7%[13]。

本研究在室内条件下测定了玫烟色棒束孢IF-1106菌株对梨小食心虫的毒力，目的在于考察该菌株作为梨小食心虫生防活性物的潜力，为其防治梨小食心虫的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1供试虫源

梨小食心虫来自于山西农业大学农学院生物安全与生物防治研究组继代培养的梨小食心虫种群[17]。

1.1.2供试菌株

玫烟色棒束孢IsariafumosoroseaIF-1106菌株，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3供试菌株孢子悬浮液的制备

玫烟色棒束孢IF-1106菌株试管斜面保存于4 ℃冰箱中。将玫烟色棒束孢转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，在(25±0.5)℃恒温条件下培养10 d。在无菌条件下，用0.1%吐温-80溶液洗脱孢子，将悬浮液在磁悬浮搅拌器上摇动30 min将成链的孢子打散，用4层医用纱布过滤除去菌丝，血球计数板估计分生孢子浓度并稀释至所需倍数。

1.2　试验方法

1.2.1对梨小卵的杀卵活性测试

试验方法以刘丽娟研究白僵菌对淡色库蚊卵的致病力测定[18]的方法为基础，参考《农药生物活性测试标准操作规范——SOP-SC-2063鳞翅目杀卵测定》并作适当修改，具体方法为：取刚孵化(放置在(26±0.8)℃、相对湿度为70%～80%、光周期为L∶D=15∶9 的培养箱中)24 h后的卵，将卵浸渍于孢子悬浮液中，1 s后取出保湿培养。每次处理20粒卵，6次重复，以0.1%吐温-80水溶液进行空白对照处理。

1.2.2对梨小幼虫的杀虫活性测试

试验方法以雷研园研究白僵菌对小菜蛾的致病力测定[19]的方法为基础，参考《农药生物活性测试标准操作规范——SOP-SC-2049鳞翅目幼虫喷雾法》，并作适当修改。具体方法为：在培养皿底部铺一张滤纸，取大小基本相同健康的梨小食心虫3龄幼虫，将幼虫放在滤纸上，取2 mL孢子悬浮液用喉头喷雾器喷雾，加入人工饲料，保湿饲养。每次处理15头幼虫，6次重复，并以0.1%吐温-80水溶液进行空白对照处理。

1.2.3对梨小蛹的杀蛹活性测试

试验方法参考徐玲研究虫生真菌对黄粉蛹的毒力测定[20]，并作适当修改。具体方法为：取刚化蛹(放置在(26±0.8)℃、相对湿度为70%～80%、光周期为L∶D=15∶9 的培养箱中)24 h后的蛹，将蛹浸渍于孢子悬浮液中，1 s后取出，在无菌滤纸片上吸干表面水分后放置在含无菌滤纸片的平皿内，保湿培养。每次处理15粒蛹，6次重复，并以0.1%吐温-80水溶液进行空白对照处理。

1.2.4对梨小成虫的杀虫活性测试

试验方法以袁盛勇球孢白僵菌对南瓜实蝇致病力测定[21]，参考《农药生物活性测试标准操作规范——SOP-SC-2044玻璃容器药膜法》方法，并作适当修改，具体为：使用试管作为药膜容器，在试管口均匀粘取药液并旋转形成均匀药液膜，稍微干燥后用该试管转移梨小食心虫成虫(使其在试管口沾上药液)至250 mL烧杯中(烧杯底部以润湿滤纸平铺，以保持容器内部湿度)，达到数量后以双层纱布封口，置于培养箱中。每次处理15头成虫，6次重复，并以0.1%吐温-80水溶液进行空白对照处理。

1.3　数据处理

根据生物测定数据，分别计算不同处理虫态的死亡(侵染)率，并以Abbott公式进行校正，即：

死亡率/%=处理死亡幼虫数×100/处理总虫数

(1)

孵化抑制率/%=处理乱未孵化数×100/处理总卵数

(2)

校正死亡率/%=(处理组死亡率-对照组死亡率)×100/(100-对照组死亡率)

(3)

校正孵化抑制率/%=(处理组孵化抑制率-对照组孵化抑制率)×100/(100-处理组孵化抑制率)

(4)

蛹校正羽化抑制率的计算公式与卵校正孵化抑制率相同。采用Origin软件绘制不同虫态的累计校正死亡率曲线图，并采用DPS软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　玫烟色棒束孢对梨小食心虫卵的致病力

不同浓度孢子悬浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)对梨小食心虫卵的校正抑制孵化率见图1。试验结果表明：玫烟色棒束孢IF1106孢子悬浮液对梨小食心虫卵的孵化有一定的影响，其中高浓度的孢子悬浮液对梨小食心虫卵孵化的抑制作用更强。随着孢子悬浮液浓度的升高对梨小食心虫卵孵化的抑制作用也逐渐增强(卵从接种后第3天开始孵化，故本试验记录第3～7天的孵化数据)。经高浓度孢子悬浮液(1×108孢子·mL-1)处理后校正孵化抑制率为79.61%，表现出较高的致病作用(表1)。被侵染的梨小食心虫卵先逐渐长出白色菌丝，后逐渐被玫烟色状菌丝完全覆盖(图2)，不再孵化。

2.2　玫烟色棒束孢对梨小食心虫幼虫的致病力

图1　不同浓度IF-1106孢子悬浮液处理梨小食心虫卵的校正孵化抑制率Fig.1　The corrected hatching inhibition rate of G. molesta of the egg treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

不同浓度孢子悬浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)对梨小食心虫幼虫的校正死亡率见图3。试验结果表明：玫烟色棒束孢IF-1106孢子悬浮液对梨小食心虫幼虫具有一定的致病力。随着孢子悬浮液浓度的升高，幼虫死亡率由35.75%增加到58.89%。孢子悬浮液浓度为1×108孢子·mL-1时，致病作用最强，为58.89%。被侵染的幼虫长出白色菌丝，虫体僵硬。

表1不同浓度孢子悬浮液对个梨小食心虫累计校正死亡(抑制)率对比/%

Table1Comparison of the cumulative corrected mortality (inhibition) rates of different concentrations of spore suspensions againstG.molesta

虫态Stage玫烟色棒束孢IF-106不同浓度孢子悬浮液/孢子·mL-1I. fumosorosea IF-1106 different concentrations of spore suspension1×1061×1071×108卵24.55C63.66B79.61A幼虫36.26C52.22B58.89A蛹8.05C70.12B100.00A成虫42.49A45.56A48.89A

注:同行不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Different letters within the same column are significantly different according to Tukey’s HSD(P<0.05).

图2　玫烟色棒束孢IF-1106侵染卵的外部症状Fig.2　External symptoms of I. fumosorosea IF-1106 infected egg

图3　不同浓度IF-1106孢子悬浮液处理梨小食心虫幼虫的累计校正死亡率Fig.3　Cumulative corrected mortality rate of G. molesta of larvae treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

2.3　玫烟色棒束孢对梨小食心虫蛹的致病力

不同浓度孢子悬浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)对梨小食心虫蛹的校正羽化抑制率见图4。试验结果表明：玫烟色棒束孢IF-1106孢子悬浮液对梨小食心虫蛹具有一定的致病力，其中高浓度的孢子悬浮液对梨小食心虫蛹羽化的抑制作用更强。随着孢子悬浮液浓度的升高对梨小食心虫蛹羽化的抑制作用也逐渐增强。随着孢子悬浮液浓度升高，对蛹羽化的抑制作用也逐渐增强，经高浓度孢子悬浮液(1×108孢子·mL-1)处理后校正羽化抑制率为100%，表现出极高的致病作用。被感染的梨小食心虫蛹表面先长出白色菌丝，后逐渐被玫烟色状菌丝完全覆盖(图5)，不再羽化。

图4　不同浓度IF-1106孢子悬浮液处理梨小食心虫蛹的校正羽化抑制率Fig.4　Corrected eclosion inhibition rate of G. molesta of pupae treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

图5　玫烟色棒束孢IF-1106侵染蛹的外部症状Fig.5　External symptoms of I. fumosorosea IF-1106 infected pupa

2.4　玫烟色棒束孢对梨小食心虫成虫的致病力

不同浓度孢子悬浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)对梨小食心虫成虫的校正死亡率见图6。试验结果表明：玫烟色棒束孢IF-1106孢子悬浮液对梨小食心虫成虫具有一定的致病力。随着孢子悬浮液浓度增加，梨小食心虫成虫的累计校正死亡率由42.49%增加到48.89%，致病作用逐渐增强。孢子悬浮液浓度为1×108孢子·mL-1时，对成虫致病作用最强，为48.89%。被侵染的成虫，虫体保湿培养后体表有玫烟色状菌丝长出。

玫烟色棒束孢IF-1106孢子悬浮液对梨小食心虫各虫态都具有一定的毒力，随着孢子悬浮液浓度的升高毒力逐渐增强。梨小食心虫的卵和蛹对玫烟色棒束孢的敏感性较高，经高浓度(1.0×108孢子·mL-1)孢子悬浮液处理后，卵的孵化抑制率为79.61%，LC50值为6.10×106孢子·mL-1(表2)；蛹的羽化抑制率为100%，LC50值为1.15×107孢子·mL-1。梨小食心虫幼虫和成虫对玫烟色棒束孢的敏感性较低，经高浓度(1.0×108孢子·mL-1)孢子悬浮液处理后，幼虫的死亡率为58.89%，成虫的死亡率为48.89%。玫烟色棒束孢IF-1106对梨小食心虫的致病力表现为蛹>卵>幼虫>成虫，表明该菌株对梨小食心虫蛹和卵具有较高防效，而对幼虫和成虫的防效较差。

图6　不同浓度IF-1106孢子悬浮液处理梨小食心虫成虫的累计校正死亡率Fig.6　Cumulative corrected mortality rate of G. molesta of adult treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

表2对梨小食心虫不同虫态的毒力测定结果
Table2The results of the virulence test on different insect states ofG.molesta

虫态Stage毒力回归方程Toxicity regression equationLC50/孢子·mL-1LC50LC50 95%置信限/孢子·mL-1LC50 (95% confidence limit)相关系数Correlation coefficient卵y=0.144 9+0.758 2x6.10×1062.71×106～1.38×1070.978 0幼虫y=2.899 7+0.298 1x2.72×107—0.978 1蛹y=8.879 5+2.074 3x1.15×1071.81×106～9.03×1060.986 8成虫y=4.325 0+0.080 8x2.27×1081.96×108～2.64×1080.999 8

3　讨论与结论

通过扫描电镜观察发现玫烟色棒束孢的分生孢子在昆虫表皮附着，孢子出现突起，分生孢子萌发形成芽管和附着胞，并紧紧附着于寄主表皮生长[22]。高浓度的孢子提高了单位昆虫体表玫烟色棒束孢的孢子数，增加了孢子侵染体表形成附着胞的几率[23]，增强了玫烟色棒束孢的致病力。刘丽娟研究了球孢白僵菌对淡色库蚊的致病力，结果表明随孢子悬浮液浓度的增加菌株对淡色库蚊卵的孵化抑制逐渐明显[18]；袁盛勇研究球孢白僵菌对扶桑绵粉蚧成虫的致病力结果表明经高浓度(2.0×108个·mL-1)孢子悬浮液处理后，成虫的累计校正死亡率最高[24]。这些研究与本试验的结果相一致，即高浓度的生防菌孢子对于成功寄主至关重要。

不同虫态对生防菌的敏感度差异较大。高浓度的玫烟色棒束孢孢子对蛹的致病力为100%，这可能与蛹的表面物质有关，这种物质有利于真菌入侵，其侵染机制还有待研究。高浓度的玫烟色棒束孢孢子悬浮液对成虫的致病力为48.89%，防治效果较差，因为高龄的幼虫和成虫的表面有一层蜡质，对分生孢子的侵入有一定的阻碍作用[25]。

利用昆虫病原真菌防治梨小食心虫不仅可以降低果实农药残留量，而且更有利于维持生态平衡，保护天敌[26]。曹仲采用白僵菌(1.75 kg·hm-2)和对硫磺做胶露剂(0.2 kg·hm-2)混合液，防治枇杷园梨小食心虫取得了较好的效果[27]。梨小食心虫越冬幼虫多在树基翘皮内越冬，经过白僵菌悬液对树基的处理，结果表明用白僵菌防治梨小食心虫越冬幼虫有一定效果[28]。陈斌等人的研究结果表明球孢白僵菌菌株在室内25 ℃条件下对西花蓟马成虫具有较高的毒力，但在自然条件下，感染球孢白僵菌的西花蓟马罹病虫体很少[29]。因此，使用玫烟色棒束孢防治梨小食心虫时，应注意玫烟色棒束孢与杀虫剂、杀菌剂的混配使用，使“以菌治虫”的生物防治技术与其他害虫防治方法协调使用；若在其越冬代羽化期间，使用玫烟色棒束孢防治梨小食心虫，可以起到降低越冬虫源的作用。此外，虫生真菌在果园自然流行，可以对果园整个季节起到生态调控作用，在测报蛹期高峰期助增精准释放，效果更加。本试验是在室内条件下进行的，分生孢子与虫体充分接触，而田间实际的温、湿度均在变化，所以玫烟色棒束孢对梨小食心虫防治效果如何，需进一步试验验证。

梨小食心虫的卵和蛹对玫烟色棒束孢的敏感性较高，经高浓度(1.0×108孢子·mL-1)孢子悬浮液处理后，卵的孵化抑制率为79.61%，LC50值为6.10×106孢子·mL-1；蛹的羽化抑制率为100%，LC50值为1.15×107孢子·mL-1。梨小食心虫幼虫和成虫对玫烟色棒束孢的敏感性较低，经高浓度(1.0×108孢子·mL-1)孢子悬浮液处理后，幼虫的死亡率为58.89%，成虫的死亡率为48.89%。本试验表明，玫烟色棒束孢IF-1106菌株可作为防治梨小食心虫的潜力菌株。