牛卵泡CMKLR1基因CDS区克隆及结构分析

郝庆玲，朱芷葳，许冬梅，李鹏飞

(山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

CMKLR1(Chemokine-like receptor 1)为趋化因子样受体1，在人类研究中也称ChemR23，属于分泌型蛋白[1]。CMKLR1在动物体内广泛表达，尤其在心肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、浆细胞样树突状细胞、脂肪细胞中显著高表达[2]。Arita等研究发现，CMKLR1在具有免疫及造血功能的组织中广泛表达，如骨髓、脾脏、胎儿肝脏、淋巴结、胸腺和阑尾等[3]。1996年Owman等从人B淋巴母细胞cDNA文库中鉴定出一段与G蛋白偶联受体家族(G-protein coupled receptor, GPCRs)高度同源的cDNA序列，将其命名为CMKLR1，后来研究证实为Chemerin脂肪因子的天然受体[4]。

目前，对CMKLR1生物学功能的研究主要有以下几方面：(1)参与免疫与炎性反应[5～7]。当动物机体出现炎性反应时，巨噬细胞和树突状细胞发挥其抗原递呈作用，向炎性反应部位集合，通过CMKLR1与其配体Chemerin相互作用，诱导胞内钙离子释放和磷酸化，同时胞外信号调节激酶ERK1/2 通过结合Gi-偶联的异源三聚体来抑制cAMP的累积，从而完成对炎性部位的免疫反应。目前认为，肥胖属于慢性低水平的炎性状态，可引起脂肪组织炎性反应。Cash等通过研究小鼠脂肪细胞的抗炎特性发现，其抗炎机理可能是Chemerin通过募集表达有CMKLR1的巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞聚集，从而激活免疫细胞发挥抗炎特性[8]；(2)调节脂肪细胞分化[9]。Goralski等通过对沙鼠的研究发现，在沙鼠脂肪细胞分化的早期阶段和脂肪细胞成熟时，CMKLR1表达显著增加；通过基因沉默技术进一步研究发现，CMKLR1在脂肪细胞分化早期(前3 d)具有重要作用，但在第4天将CMKLR1基因沉默，则对脂肪细胞分化和脂肪细胞表型无明显影响；(3)参与胰岛素抵抗[10]。Takahashi等通过培养小鼠3T3-L1细胞研究发现，CMKLR1与其配体Chemerin相互作用，可显著增加胰岛素刺激引起的葡萄糖摄入，并能提高ISR-1(胰岛素受体底物-1)酪氨酸的磷酸化水平，增强胰岛素刺激信号。

课题组前期对牛卵泡颗粒细胞(Granulosa cells, GCs)转录组测序研究发现，CMKLR1 mRNA在从属卵泡表达量极显著高于优势卵泡，提示CMKLR1对牛卵泡发育具有重要调控作用[11]。因此，本研究选取牛卵泡作为研究对象，经RT-PCR扩增并克隆牛CMKLR1全CDS区，对其编码的蛋白序列进行结构和功能分析，为后期深入研究CMKLR1对牛卵泡发育的影响奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

本试验材料来源于山西省文水县肉牛屠宰场，选择海福特母牛，屠宰后采集双侧均正常发育卵巢，投入DPBS中带回实验室，修剪卵泡并分离GCs，-80 ℃保存。

试验中用到的试剂主要包括：Trizol、反转录试剂盒、DNA Marker 2000、Tap DNA 聚合酶、dNTP、琼脂糖(均购自TAKARA)。

1.2　试验方法

1.2.1颗粒细胞分离

选择直径>5 mm的卵泡，在盛有DPBS的平皿中从中线剪开，小心刮取卵泡内细胞并丢弃卵泡膜性组织，将平皿内物质转移至离心管，4 ℃-Z1 400 r·min-1离心5 min，弃上清即为GCs。

1.2.2引物的设计与合成

参考GenBank提供的牛CMKLR1 mRNA(NM_001145235.1)核酸序列，Primer 5.0设计特异性引物，交由TAKARA公司合成，引物序列如下：

上游：5'-ATGGAGGCTGAGGATTACAACGCCTC-3'

下游：5'-TCAGAGCATGCCAGTCTCCCTC-TCGT-3'

1.2.3总RNA抽提与RT-PCR

Trizol法提取GCs总RNA，经核酸测定仪检测合格后，对总RNA进行反转录，反应体系10 μL：5×Prime Script TM Buffer 2 μL，Prime Script TMRT Enzyme Mix1 0.5 μL，Oligo dT Primer 25 pmol，随机引物50 pmol，Total RNA 1 μL，DEPC定容至10 μL，混匀后置于PCR仪，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.4全CDS区扩增

扩增体系为：10×PCR buffer 2.5 μL， dNTP 2 μL，上下游特异性PCR引物各0.5 μL，反转录cDNA 2 μL，Taq聚合酶0.25 μL，ddH2O加至25 μL。扩增程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，58.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40循环；72 ℃延伸10 min。1%凝胶电泳检测后胶回收试盒回收纯化PCR产物，送交TAKARA公司测序。

1.3　生物信息学分析

测序结果CDS区分析应用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)；NCBI在线BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对24种动物CMKLR1氨基酸序列比对分析；在线软件NetOGlyc4.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)、NetNGlyc1.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetPhos 3.1(www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对CMKLR1一级结构O-糖基化、N-糖基化和磷酸化位点分别分析；3D结构和结构域用 Conserved Domain Search Services (CD Search) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析。

2　结果与分析

2.1　RT-PCR分析

总RNA提取后，经核酸检测仪检测，RNA浓度和纯度均符合后续实验要求。PCR扩增结束后，凝胶电泳检测可见条带大小为1 100 bp左右，与预期结果相符(图1)。

2.2　牛卵泡CMKLR1序列分析

测序结果显示，牛卵泡CMKLR1基因CDS区全长1 089 bp，编码362个氨基酸；HMMTOP v2.0分析表明，CMKLR1蛋白序列中存在7个跨膜区段(图2中下划线部分)，分别位于36～60、73～96、111～130、151～172、220～239、256～276和291～315区段，符合GPCRs的结构特征。

图1　目的片段RT-PCR电泳图Fig.1　Electrophoresis pattern of RT-PCR product注: M: DNA Marker; T: 目的产物Note: M: DNA Marker; T: Target product

图2　CMKLR1序列分析Fig.2　CMKLR1 sequence analysis注: *:终止子; 下划线: 跨膜区段Note: *:Terminator; Underscore: Transmembrane section.

2.3　CMKLR1多序列比对及聚类分析

将牛卵泡CMKLR1全CDS区序列翻译为氨基酸序列，经NCBI数据库搜索获得其它24种动物对应的氨基酸序列，BLAST分析软件对序列进行比对。结果表明，该序列与北美野牛序列相似性最高(99.4%)，与其它动物序列相似性为80.0%～96.7%，表明CMKLR1在物种进化过程中保守性较强(图3)。

图3　多物种氨基酸序列比对Fig.3　Multi-species amino acid sequence alignment.

基于不同动物(包括偶蹄类、长鼻类、鲸类、灵长类、食肉类和啮齿类)CMKLR1氨基酸序列聚类分析，应用遗传距离邻近法系统发育分析(图4)表明，牛(Bostaurus)与北美野牛(Bisonbison)遗传距离最近，与马岛刺猬(Echinopstelfairi)遗传距离最远。

图4　CMKLR1氨基酸序列构建系统发生树Fig.4　Phylogenetic tree based on amino acid sequences of CMKLR1

2.4　牛CMKLR1糖基化和磷酸化位点分析

NetOGlyc 4.0软件分析表明CMKLR1有4个O-糖基化位点(评分阈值>0.5)，分别为第195位、第196位、第209位和第344位(表1)。

NetNGlyc 1.0分析表明，CMKLR1不存在信号肽，没有暴露N-糖基化位点的机制存在。预测结果仅提示在第7位可能是潜在的N-糖基化位点(评分阈值>0.5)，第187位评分值较低，形成N-糖基化的可能性较小(表2)。

NetPhos 3.1分析表明：CMKLR1氨基酸序列从6～353位共有50个潜在的磷酸化位点(图5，评分阈值>0.5)，磷酸化位点的激酶种类包括unsp, EGFR, CKII, CKI, DNAPK, p38MAPK, PKC, PKA, cdc2和CaM-II共10种。大量位点的存在和激酶的多样性也表明了CMKLR1功能调节的复杂性。

表1　CMKLR1 O-糖基化位点预测Table 1　Predicted O-glycosylation of CMKLR1

表2　CMKLR1 N-糖基化位点预测Table 2　Predicted N-glycosylation of CMKLR1

图5　CMKLR1磷酸化位点预测Fig.5　Predicted phosphorylation of CMKLR1

2.5　牛CMKLR1三级结构预测

由PDB数据库和CDD数据库预测CMKLR1三级结构和功能结构域(图6)，结果显示：氨基酸序列36～315之间共形成7个平行排列的螺旋结构(图6 A)，并7次横跨胞膜；功能域分析也进一步表明7次跨膜结构(7tm)对CMKLR1功能的决定作用，属于典型的GPCRs(图6B)。

图6　CMKLR1立体结构和功能域预测Fig.6　Predicted 3D structure and functional domains of CMKLR1

3　讨论与结论

蛋白质糖基化修饰过程对蛋白翻译、降解、免疫保护以及信号调控等功能执行具有重要意义，如大多数转录因子和酶类物质均存在翻译后糖基化修饰[12]；而磷酸化修饰过程对蛋白质调控细胞增殖、发育、分化以及信号转导等生命活动有关键作用，如CDKs(Ser/Thr激酶)通过激活周期蛋白并形成复合物，参与细胞周期调控[13]，细胞内NADPH 氧化酶和电子传递链相关蛋白均存在磷酸化调控过程[14]。氨基酸序列结构分析表明，CMKLR1分子中存在4个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和50个磷酸化位点。大量翻译后修饰位点的存在，保证了CMKLR1在不同器官、组织和细胞中执行生物功能时，通过精确的调控发挥其多样化功能。

三级结构和功能域预测分析结果表明，CMKLR1蛋白分子具有典型的G蛋白偶联受体家族7次跨膜(7tm)结构存在。该结构的特点是空间结构中均有7个跨膜α螺旋，并将蛋白分割为膜内C端、膜外N端、3个膜内Loop环和3个膜外Loop环，且C端和膜内Loop环上均有鸟苷酸环化酶结合位点[15]。人类β2肾上腺素能受体结构是第一个被揭示的GPCR，并于2011年对其晶体结构成功解析[16，17]。由于GPCRs立体结构在胞膜内外都有Loop环存在，使得其结构的稳定性较差。GPCRs结构解析对应用研究意义重大，GPCRs作为药物靶点设计具有广泛的应用前景[18]。

CMKLR1作为GPCRs，对蛋白激活和炎性部位趋药性调节具有重要作用[19]。体外试验和动物在体试验表明，CMKLR1通过信号传导调节局部炎症或组织损伤部位细胞CMKLR1的过表达，从而发挥抗炎作用[19，20]。研究表明，CMKLR1对人和大鼠生殖功能具有调控作用[21，22]；动物卵泡的生长和分化依赖于促性腺激素、细胞因子和生长因子严格调控以及卵泡GCs、膜细胞和卵母细胞之间的相互调节[23]；反之，卵泡细胞之间的相互作用对卵泡的形成和类固醇激素的分泌至关重要[24～26]。Wang等研究表明，长期对老鼠模型雄激素刺激，卵巢和循环系统的趋化素水平显著升高，卵泡高水平的CMKLR1会抑制FSH诱导的GCs类固醇激素生成[27]。然而，不同发育阶段牛卵泡CMKLR1的表达模式及其对卵泡发育的调控机理仍不清楚，本研究对牛卵泡CMKLR1结构分析和功能预测，为后期深入研究CMKLR1调控牛卵泡发育奠定了基础。