传染性法氏囊病毒VP2蛋白的高效表达与免疫原性分析

杨　棋，魏　蔷，刘运超，冯　华，蒋大伟，陈玉梅，张改平*

(1.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州450002； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002)

鸡传染性法氏囊病(IBD)最初在20世纪60年代被发现，该疾病是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一种急性、高度传染性的免疫抑制性疾病，危害世界所有主要的家禽产区[1-2]。IBDV是一种无囊膜的病毒，属于Birnaviridae家族，基因组由A、B 2段双链RNA组成。A节段包含2个部分重叠的开放阅读框，其中较小的阅读框编码非结构蛋白VP5，较大的阅读框编码一个多聚蛋白[3]。多聚蛋白自裂解形成病毒蛋白VP2、VP3和VP4[4]，其中VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，为病毒核衣壳的主要成分。VP2含有血清型特异性并能诱导中和抗体产生的构象依赖型抗原决定簇,其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受 IBDV的感染，是 IBDV的保护性抗原，具有特异性[5]。研究表明，VP2与病毒毒力和细胞嗜性有关[6]。B节段主要编码VP1蛋白，其是一种RNA依赖的RNA聚合酶[7-8]。

传染性法氏囊病给家禽业造成巨大的经济损失，目前尚无特效药可以治疗，主要应用疫苗进行预防，所用疫苗主要为灭活疫苗和冻干活疫苗以及新型的基因工程亚单位疫苗[9]。其中，IBD基因工程亚单位疫苗具有较好的免疫原性，副作用相对较小，是一种应用前景广阔的禽病疫苗[10]。当前IBD基因工程亚单位疫苗主要受困于重组蛋白的表达量以及生产成本等因素。原核表达系统具有操作简便、生产成本低、实际应用前景好等优点，利用埃希氏大肠杆菌表达系统表达所得的VP2蛋白已经被证明具有高度的免疫保护原性[11]。为了提高外源基因的表达水平、大量制备具有生物活性的目标蛋白，长期以来研究人员尝试优化了表达菌株的生长温度、培养基组成、诱导物浓度等[12]，但是VP2可溶性蛋白的表达量仍然有待进一步提高。为此，本研究通过广泛筛选多种表达菌株，确定VP2蛋白的高效表达菌株，并测定了所表达VP2蛋白的免疫原性，为IBD新型基因工程亚单位疫苗的研究提供新的参考信息。

1　材料和方法

1.1　材料

原核表达载体pET-28a(+)由本实验室保存，IBDV B87株重组质粒pUC57-VP2由上海生工生物工程有限公司合成，感受态细胞BL21(DE3)、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS购自北京华越洋生物科技限公司，Rosetta(DE3)购自上海唯地生物技术有限公司，鸡传染性法氏囊病抗原快速检测试纸购自河南省百奥生物工程有限公司，His-Tag单抗购自Proteintech公司、羊抗鼠二抗购自Jackson公司，AEC酶底物试剂盒购自无锡傲锐东源生物科技有限公司，鸡新城疫、传染性法氏囊病二连灭活疫苗(La Sota株+HQ株)购自辽宁益康生物股份有限公司，IBDV标准强毒株 BC6/85和标准阳性抗原均购自中国兽医药品监察所，阳性血清由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备，SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2　VP2基因原核表达载体的构建

将原核表达载体pET-28a(+)质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段；以重组质粒pUC57-VP2中VP2的序列为模板进行PCR扩增，并将扩增的目的片段用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收VP2基因；二者连接后转化JM109感受态细胞，重组质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，将阳性重组表达质粒命名为pET28a-VP2。

1.3　重组VP2蛋白高效表达菌株的筛选

将1 μL重组质粒pET28a-VP2分别转化BL21(DE3)、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)感受态细胞，挑取固体培养基平板上生长状态良好的单克隆菌落，不同菌株各选取5个单菌落，然后诱导表达蛋白质，活化菌体2～2.5 h，当其OD600 nm值在0.6～0.9时，加入诱导剂IPTG,浓度为1 mmol/L，诱导时间10 h，诱导温度为37 ℃，诱导结束后12 000 r/min离心收集菌体，弃培养液。将收集到的菌体用PBS缓冲液重悬，并调节每种菌体浓度，然后使用分光光度计测量OD600 nm值，使其终值为1.8左右，最后将菌体悬浮液超声破碎(振动频率50 Hz，工作5 s间歇5 s，持续10 min)，破碎完成后分离收集上清(转速12 000 r/min、4 ℃离心20 min)，弃沉淀。将IBDV VP2可溶性蛋白上清液100 μL倍比稀释10、100、1 000、10 000倍，稀释液选用PBS缓冲液，然后利用鸡传染性法氏囊病抗原快速检测试纸检测，鉴定每类菌株可溶性蛋白上清的最大显色稀释倍数，从而筛选出高效表达VP2蛋白的菌株。

1.4　重组VP2蛋白的表达验证

将筛选到的高效表达菌株BL21(DE3)分别于18、30、37 ℃下诱导表达VP2蛋白，诱导剂浓度为1 mmol/L，诱导时间10 h,诱导结束后12 000 r/min离心收集菌体，弃培养液。将收集到的菌体用1/10体积的PBS缓冲液重悬，即1 mL PBS缓冲液重悬10 mL离心后收集到的菌体，将重悬后的菌体悬浮液超声破碎(振动频率50 Hz，工作5 s间歇5 s，持续10 min)，破碎完成后分离收集上清(转速12 000 r/min、4 ℃离心20 min)，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对VP2可溶性蛋白的表达进行验证。

1.5　重组VP2蛋白的免疫原性分析

1.5.1琼脂扩散试验(AGP)检测VP2蛋白效价制备琼脂平板，中央孔滴加法氏囊病毒标准阳性血清，将表达产物按1∶2、1∶4、1∶8、1∶6、1∶32、1∶64倍稀释，周边孔由高到低分别滴加稀释蛋白液，设置标准抗原阳性对照和PBS阴性对照，抗原和血清加入量以加满不溢出为度，样品加毕后，将琼脂平板加盖平放于加盖的湿盒内，37 ℃温箱中孵育24～48 h，观察并记录结果。

1.5.2VP2蛋白的动物免疫将表达的VP2重组蛋白与ISA71佐剂混合乳化制备免疫原，同时设置商业疫苗和PBS对照组，进行SPF鸡肌内注射免疫，每组5只，试验组免疫剂量为10 μg/只，商业疫苗0.3 mL/只，PBS组0.3 mL/只，并分别于免疫28 d后翅下静脉采血，分离血清。

1.5.3免疫血清的AGP效价检测制备琼脂平板，中央孔滴加法氏囊病毒标准毒株(BC6/85)，将制备的血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶6、1∶32、1∶64倍稀释，周边孔由高到低分别滴加稀释的血清抗体，并设置阳性对照组，加入量以加满不溢出为度，样品加毕后，将琼脂平皿加盖平放于加盖的湿盒内，37 ℃温箱中孵育24～48 h，观察并记录结果。

2　结果与分析

2.1　重组质粒pET28a-VP2的酶切鉴定

从经过活化的重组菌JM109(含pET28a-VP2)菌液中提取质粒，利用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶进行双酶切鉴定。如图1显示，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，得到的目的片段及载体的大小分别与VP2片段和pET-28a(+)载体的理论大小一致，VP2约为1.4 kb，表明重组表达载体pET28a-VP2构建成功，测序结果显示重组载体中的VP2片段序列正确。

1：DNA Marker λ Hind Ⅲ； 2、3：pET28a-VP2双酶切；

2.2　重组VP2蛋白的表达及高效菌株的筛选

如图2所示，BL21(DE3)、Tuner(DE3)pLysS诱导表达的蛋白质产物可溶性上清样品可以使鸡传染性法氏囊病快速检测试纸条标准线和检测线都显色，因此判定为阳性；Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)诱导表达的蛋白质上清样品被检测时只有标准线显色而检测线未能显色，因此判定为阴性。试验结果表明，BL21(DE3)、Tuner(DE3)pLysS可以诱导表达具有反应原性的VP2蛋白，而Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)并不具备表达VP2蛋白的能力。将筛选出来的2种具有表达VP2蛋白能力的菌株进行诱导表达，重悬菌体，调整其OD600 nm=1.8，超声破碎后的上清利用鸡传染性法氏囊病快速检测试纸条检测，结果发现，BL21(DE3)表达的VP2可溶性蛋白上清在稀释10、100、1 000倍时，试纸条检测均呈阳性；Tuner(DE3)pLysS表达的VP2可溶性蛋白上清在稀释10、100倍时，试纸条检测呈阳性，增大稀释倍数至1 000倍，便检测不到呈阳性。

试验结果表明，BL21(DE3)菌株具有高效表达VP2可溶性蛋白的能力，可作为候选的高效表达菌株进行诱导表达条件优化，从而提高VP2蛋白表达量。

1：BL21(DE3)诱导表达蛋白破碎上清液；2：BL21(DE3)诱导表达蛋白破碎上清液稀释10倍；3：BL21(DE3)诱导表达蛋白破碎上清液稀释100倍；4：BL21(DE3)诱导表达蛋白破碎上清液稀释1 000倍；5：Tuner(DE3)pLysS诱导表达蛋白破碎上清液；6：Tuner(DE3)pLysS诱导表达蛋白破碎上清液稀释10倍；7：Tuner(DE3)pLysS诱导表达蛋白破碎上清液稀释100倍；8：Tuner(DE3)诱导表达蛋白破碎上清液；9：Rosetta(DE3)诱导表达蛋白破碎上清液

2.3　重组VP2蛋白的表达验证

将诱导表达的VP2可溶性蛋白利用SDS-PAGE进行分析，如图3所示，在约48 ku处出现一个条带，与预期结果相符。然后将SDA-PAGE胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，以His-Tag单抗作为一抗，HRP标记过的羊抗鼠IgG作为二抗，经过AEC酶底物试剂盒显色后，在相应的位置出现了一条特异性的抗原抗体反应显色条带，证明表达的目的蛋白是VP2蛋白，并且具有较好的反应原性。

1：彩虹180广谱蛋白质Marker； 2：37 ℃诱导；3：30 ℃诱导； 4：18 ℃诱导图3　VP2可溶性蛋白的表达分析

2.4　重组VP2蛋白的免疫原性分析

2.4.1重组VP2蛋白的AGP效价检测将表达所得的重组VP2蛋白利用AGP试验分析，设置对照组，其中标准抗原阳性对照能检测到沉淀线，PBS阴性对照未检测到沉淀线，同时表达的VP2蛋白可以与标准阳性血清反应形成沉淀线，并且将其进行1∶64稀释时仍然能够明显地观测到沉淀线(表1)，表明表达的VP2蛋白具有良好的反应原性，并且具有较高的表达量。

表1　重组VP2蛋白的AGP效价检测

注：“++”表示沉淀线清晰可见,“+”表示可见，下同。

2.4.2免疫血清的AGP效价检测将表达的VP2重组蛋白与ISA71佐剂混合乳化后制备免疫原，肌内注射SPF鸡进行免疫，分离的抗体血清进行AGP试验鉴定。如表2显示，商业疫苗组血清AGP效价可达1∶64，PBS组效价为0，而重组蛋白血清的AGP效价为1∶6，能检测到沉淀线，表明诱导表达产物 VP2 蛋白可有效刺激鸡体产生体液免疫应答反应并获得较高的抗体水平。

表2　免疫血清的AGP效价检测

注：“-”表示沉淀线不可见。

3　结论与讨论

VP2蛋白构成IBDV的外衣壳，约占病毒总蛋白质的51%，是IBDV的主要结构蛋白和功能蛋白[2]，已经被国内外学者广泛研究。由于IBDV的毒力分子基础和致病性分子标志主要在VP2上[6]，因此VP2蛋白也是近年来IBDV新型亚单位疫苗研究的热点。目前，IBDV主要宿主保护性抗原VP2蛋白已在大肠杆菌、酵母、真核细胞、病毒等多种表达系统中得到表达[13-16]。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,具有培养操作简单、转化效率高、价格相对经济、生长培养速度快、可大量生产所需蛋白质等优点[17]，是表达重组蛋白的首选宿主之一，目前已经用来表达多种酶制剂和药物制剂，市场上有40% 的重组制剂由大肠杆菌表达生产[18]。

本研究将构建好的B87毒株 pET28a-VP2转化至大肠杆菌中进行蛋白质表达，利用法氏囊病快速检测试纸进行高效表达菌株的筛选，同时进行了VP2蛋白的表达鉴定，确定了BL21(DE3)作为VP2可溶性蛋白的高效表达菌株，然后进一步通过AGP试验鉴定了重组VP2蛋白的反应原性。目前对鸡法氏囊病的诊断已有多种方法，经典的检测方法为AGP试验，其次为酶联免疫吸附试验等[19]。经AGP试验鉴定，重组表达的VP2蛋白能够和IBDV标准阳性血清抗体结合发生反应形成沉淀线，其AGP效价可达1∶64。据报道，国内相关实验室利用原核表达得到的VP2蛋白，AGP效价为1∶32[20]，这表明本研究获得的重组VP2可溶性蛋白表达量较高，且具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白以肌内注射方式接种试验鸡，对血清抗体进行AGP检测，结果表明，其AGP效价不如商业疫苗组，达到1∶6，通过查阅相关文献[21]可知，这一抗体水平可以实现对鸡群的保护。因此，本研究表达的重组VP2蛋白可有效刺激鸡体产生体液免疫应答反应，获得较高的抗体水平，增强鸡对IBDV的抵抗能力。