斑玉蕈菌种连续传代对其生产性能的影响

林　辉，詹森然，李佳欢，金文松，孙淑静，胡开辉

(福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002)

食用菌菌种质量直接关系到出菇产量的高低和栽培的成败[1]，它是食用菌生产的基础。

目前，食用菌栽培主要使用固体菌种，农业部门对菌种生产的监督管理主要停留在母种和原种的生产许可上，栽培种基本上由农户自行联合扩繁[2]。由于条件设施、认识水平和管理水平不足，栽培种扩繁不规范，容易造成扩繁过程菌种隐性污染。另外，菌种的培养时间及外界环境把控不精准，菌种质量难以保障，并且依次继代培养制备栽培种，存在菌种退化现象。随着菌种制备设施升级与管理水平的提高，大部分问题都已经得到有效的解决，但是菌种继代培养造成的退化现象仍然是食用菌生产的突出问题。菌种的退化造成菌落生长速度不一致，菌丝体吃料速度减慢或不吃料，气生菌丝稀疏或出现扇变菌落，出菇(耳)期延长、菇潮不明显，畸形菇增多，品质、产量下降，抗性降低等[3]。

斑玉蕈(Hypsizygusmarmoreus)是我国工厂化生产的主要食用菌菌类品种之一，生产周期长，从接种到采摘需要120 d。使用退化的斑玉蕈菌种种植一段时间后，会出现大规模减产，增加了斑玉蕈工厂化种植的风险。因此，建立一套斑玉蕈菌种质量控制体系，明确菌种使用代数成为目前斑玉蕈工厂化亟需解决的问题。已有研究表明，通过生理生化角度判断菌种质量是有效的[4]。贺元川等[5]通过香灰菌的传代培养进行银耳种植，发现随着传代次数的增加，漆酶、纤维素酶活力逐渐降低，银耳产量下降。本试验通过斑玉蕈菌种连续继代培养，分析测定不同代数斑玉蕈菌种关键酶活性、生理特性的变化及出菇情况，探讨斑玉蕈连续传代过程中的菌种退化情况，以明确斑玉蕈菌种用种代数，为斑玉蕈工厂化栽培提供基础。

1　材料和方法

1.1　试验材料

1.1.1供试菌株斑玉蕈通过继代培养获得的10代菌种保存于福建农林大学(古田)菌业研究院。

不同代数菌种制备：取斑玉蕈试管种(原种)，将其直接接种在装有固体栽培料40 g的大试管中，培养30 d。将走满大试管的斑玉蕈进行保种，即为第1代菌种，同时将第1代菌种继续转接至装有40 g栽培料的大试管种，培养30 d，进行保种，即为第2代菌种，同时将第2代菌种继续转接至装有40 g栽培料的大试管中，培养30 d。以此类推，直至第10代菌种。获得原种和10代不同传代次数的菌种。

1.1.2培养基(1)固体PDA培养基(1 L)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、酵母粉3 g、MgSO7·7H2O 1.5 g、KH2PO41.5 g、VB 10.1 g。121 ℃灭菌30 min，冷却后备用。

1.1.3栽培料配方棉籽壳53%、木屑17%、石灰2%、麸皮23%、玉米粉5%、含水量65%。121℃灭菌120 min，冷却后备用。

1.2　测定项目及方法

1.2.1不同代数菌种菌丝生长质含量的测定将不同代数斑玉蕈接种至PDA平板，每代接3个平板，放置在24 ℃培养箱中培养12 d，待平板长满后用打孔(孔径1 cm)的方式转接到其他平板上，每代菌种接10个平板，菌丝萌发后每天测量其生长速度，直到平板长满。

1.2.2不同代数菌种基质降解酶活性、还原糖与可溶性蛋白质含量的测定粗酶液提取：将不同代数斑玉蕈接种在装有固体栽培料40 g的大试管中，培养30 d，菌丝走满栽培料。将试管栽培料取出揉碎、混匀，精确称取10 g，加入50 mL水，26 ℃，120 r/min摇床2 h。8 000 r/min，4 ℃离心15 min。上清液即为粗酶液，测定酶活力、可溶性蛋白和还原糖含量。

酶活力的测定：淀粉酶测定采用碘试液比色法[6]；漆酶测定采用ABTS法[7]；可溶性蛋白质测定采用考马斯亮蓝法[8]；还原糖测定采用DNS法[9]；纤维素酶测定采用CMC-Na法[10]；木聚糖酶测定采用木聚糖降解法[11]；中性蛋白酶测定参照标准GB/T 23527—2009进行[12]。

1.3　不同代数菌种出菇试验

取活化后的不同代数的斑玉蕈菌种接入装有200 g栽培料的栽培瓶中，各接50瓶，接完种的栽培瓶置于25 ℃养菌房内养菌，培养90 d。将所有的栽培瓶转移至宁德市古田县福泉鑫生物科技有限公司出菇房进行统一出菇。待出菇完毕后，各代随机抽取10瓶栽培瓶分别测定菇质量与出菇蕾数、菇盖直径、菇的长度等农艺性状。

1.4　数据处理

试验数据使用Excel软件进行处理。

2　结果与分析

2.1　继代培养对斑玉蕈菌种菌丝生长速度的影响

菌丝的生长速度是目前判断菌种菌丝活力最直观、最常见、最快速的方法。由表1可以看出，不同代数斑玉蕈菌种在固体PDA培养基上菌丝生长速度差异较大，0～4代速度较快，4代以后的菌种菌丝生长速度则明显下降，第10代菌种生长速度仅为1.36 mm/d，相对亲本菌株生长速度降低27%。

表1　不同代数斑玉蕈菌种的菌丝生长速度

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

2.2　继代培养对斑玉蕈菌种还原糖与可溶性蛋白质含量的影响

斑玉蕈不能直接利用栽培料中木质纤维素等多糖类物质，需要通过分泌相关的胞外酶将其降解为可直接吸收的还原糖，而这些胞外基质降解酶是可溶性蛋白质的主要组成部分。因此还原糖、可溶性蛋白质的含量可以反映出斑玉蕈分解利用基质的强度及菌丝营养供给水平。由表2可看出，0～4代斑玉蕈的还原糖含量高(>5 mg/mL)，4代以后还原糖含量随着菌种传代次数的增加逐渐下降；4～10代菌种的胞外可溶性蛋白质含量略低于0～3代。说明0～4代斑玉蕈的菌丝代谢较为旺盛，碳水化合物转化快，随着菌种传代次数的继续增加，菌丝营养供给水平降低，代谢能力有所下降。

表2　不同代数斑玉蕈菌种生长过程中还原糖与可溶性蛋白质含量的变化

2.3　继代培养对斑玉蕈菌种关键酶活力的影响

栽培料主要含有蛋白类与纤维素、木质素、淀粉等多糖类营养物质，需要蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、淀粉酶等基质降解酶分解为单糖，供应菌丝生长代谢的需要。因此菌种胞外基质降解酶的活性可以直接反映出对基质降解利用情况与菌丝生长代谢情况，是菌种质量判断的重要指标。

由表3可以看出， 0～10代斑玉蕈在培养过程中的中性蛋白酶、木聚糖酶和漆酶活性随着菌种传代次数的增加呈下降趋势，其中0～4代斑玉蕈的中性蛋白酶和漆酶活性较高、变化较小， 5～6代中性蛋白酶和漆酶活性略有降低，7代以后蛋白酶和漆酶活性显著下降，至第10代蛋白酶和漆酶酶活力分别下降38%、25%。0～6代斑玉蕈菌种的木聚糖酶活性随着传代次数的增加显著降低，第6代以后木聚糖酶活性基本不变，保持在34.6 U/L左右。0～10代斑玉蕈菌种的淀粉酶活性均在22.03～23.14 U/mL，酶活力基本保持稳定。而0～10代斑玉蕈菌种的羧甲基纤维素酶活性随着菌种传代次数的增加逐渐提高，第10代的纤维素酶活力相对原始菌种提高了3.01 U/mL，这可能是由于真菌继代过程中在其他基质降解酶活力降低、代谢紊乱情况下的一种生物体的自我应急保护机制。

表3　不同代数斑玉蕈菌种生长过程中关键酶活力的变化

续表3　不同代数斑玉蕈菌种生长过程中关键酶活力的变化

2.4　继代培养对斑玉蕈菌种出菇产量和农艺性状的影响

从图1可以看出，从0～4代斑玉蕈的菇整体较为整齐，一致性好，菇枞硕大，菇体较为粗壮，菇柄较粗，菇盖较厚较大；5～6代斑玉蕈的菇较为整齐，但菇体比前几代较细、矮；7～10代则表现出菇体较为矮小，菇柄较细，菇盖直径较小，大小不一，且菇枞稀疏。

图1　不同代数斑玉蕈菌种的出菇情况

由图2可知，0～5代斑玉蕈的子实体鲜质量较高，均大于55 g；而第6～10代斑玉蕈的子实体鲜质量较低，均小于51 g。说明斑玉蕈经过连续10次的传代后，在生产上，0～5代的产量保持较高水平，而6代后产量明显下降，特别是8～10代出现严重减产，第10代产量仅为28.7 g/瓶。

图2　不同代数斑玉蕈菌种的子实体鲜质量

由表4可以看出，0～5代斑玉蕈的出蕾数与菇数多，5代后菇数与出菇数随着传代次数增加逐渐减少。从菇盖的直径看，0～4代菇盖直径较5～10代大，成品菇(菌柄长度≥8 cm)的变化规律与菌盖直径变化情况一致。9～10代的斑玉蕈菌柄长度显著降低。综上，说明在不同代数斑玉蕈菌种的出菇质量中，0～4代斑玉蕈菌种的出菇质量优于5～10代斑玉蕈菌种，尤其是7代后的斑玉蕈菌种，出菇数量少，菇体发育差。

表4　不同代数斑玉蕈菌种的子实体农艺性状

3　结论与讨论

目前我国菌种市场比较混乱，优质菌种引进后连续转管，工厂与菌种商不了解多次继代培养后菌种退化对生产造成的严重后果，通过对斑玉蕈继代培养过程中生理生化与农艺性状指标的测定，探索斑玉蕈连续传代过程中的退化情况，可以为工厂用种规范提供借鉴。

从不同代数斑玉蕈生理生化特性测定结果可以看出，斑玉蕈菌种在连续传代过程中，传代至第4代后，菌丝生长速度逐渐降低，这与李晓等[13]的黑木耳母种继代培养研究结果相同；还原糖含量随着传代次数的增加逐渐下降，4～10代菌种的胞外可溶性蛋白质含量略低于0～3代，原料降解速度与营养供给水平下降，这与刘贵巧等[14]、王东明等[15]在平菇与香菇的研究结果一致。在基质降解酶的方面，0～4代斑玉蕈关键酶活力基本保持不变，4代以后中性蛋白酶、漆酶、木聚糖酶活力开始大幅度下降，对基质培养料的降解能力下降。马丹丹等[16]、李莎等[17]利用食用菌分泌漆酶作为快速判断金针菇、白灵菇菌种退化程度的参数；淀粉酶在斑玉蕈传代过程中酶活力基本不变；而纤维素酶活力在斑玉蕈传代至第6代以后，随着传代次数的增加逐渐提高，这一现象与中性蛋白酶、漆酶、木聚糖酶活力表现相反，这可能是由于斑玉蕈在生长发育过程中代谢紊乱情况下的一种自我应激调节机制。

出菇表现上，0～4代出菇产量较高，而第4代以后出菇产量明显降低；其中，0～4代蕾数、菇数、成品菇数量多，菇体在菌柄长度和菌盖直径上较大，4代后菌种蕾数、菇数、成品菇数量减少，菇体菌柄长度与菌盖直径减小。

综上所述，斑玉蕈在菌种使用上4代以内为宜，4代后生产性能降低，对原料的降解能力与营养供给水平显著下降，减产明显。