不同种类及不同配比的激素和碳源对大麦幼胚愈伤组织诱导及分化的影响

2018-07-10，，，，

种子 2018年6期

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(天津农学院农学与资源环境学院，　天津 300384)

世界谷类作物中，大麦的种植总面积和总产量仅次于小麦、水稻、玉米而居第4位，是重要的农作物。通过组织培养的方法诱导大麦愈伤组织，分化出新的植株，是大麦转基因、抗逆性等诸多研究的基础。而在几种禾本科作物中，大麦组织培养的研究略晚，目前仍处于再生体系的建立和完善阶段[1]。建立大麦再生体系首先需要高效诱导大麦愈伤组织。郭晓琳[2]利用大麦成熟胚诱导愈伤组织，但是诱导率低，质量较差，大部分品种难以再生。闫永荣研究表明，大麦幼胚具有较快的生长速度和较佳的生理状态，是获得再生植株最有效的外植体[3]。本研究采用大麦Morex的幼胚作为实验材料，分析不同2,4-D浓度及不同碳源(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖)对大麦幼胚愈伤组织诱导及不同浓度配比的6-BA/IAA对诱导出的愈伤分化的影响，为建立高效大麦再生体系和后期各项大麦研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材　料

大麦Morex幼胚。

1.2　方　法

1.2.1培养基

诱导愈伤的培养基①：MS+20 g/L蔗糖+10 g/L麦芽糖+2,4-D+6.5 g/L琼脂(pH=5.8)，不同2,4-D浓度梯度见表1。

表1大麦Morex幼胚愈伤诱导的不同2,4-D浓度

激素浓度(mg/L)2,4-D234567

诱导愈伤的培养基②：MS+碳源+6 mg/L 2,4-D+6.5 g/L琼脂(pH=5.8)，不同碳源浓度梯度见表2。

表2大麦Morex幼胚愈伤诱导的碳源种类及浓度

碳源浓度(g/L)蔗糖2030405060葡萄糖2030405060蔗糖+麦芽糖10+1020+1030+1040+1050+10

分化培养基：MS+40 g/L 蔗糖+6-BA/IAA+6.5 g/L琼脂(pH=5.8)，不同6-BA与IAA浓度配比见表3。

表3大麦Morex幼胚愈伤分化激素配比

激素浓度(mg/L)6-BA/IAA0.5/0.11.0/0.11.5/0.12.0/0.13/0.16-BA/IAA0.5/0.21.0/0.21.5/0.22.0/0.23/0.2

1.2.2材料处理

将幼嫩的大麦种子浸泡在蒸馏水中，在无菌操作台中，用75%的酒精处理30 s，无菌水洗净，再用10%的次氯酸钠处理30 min，无菌水洗5次，每次3 min。将大麦种子放在无菌培养皿中用无菌解剖针挤出幼胚后纵切，接入培养基中，每瓶接种6个纵切胚，每个处理接种20瓶，3次重复。放入培养室黑暗培养15 d进行数据统计。

1.2.3继代与分化培养

按照上述步骤方法，计算得出湖南省2001～2015年各个年份的城市化系统与生态环境系统综合指数、综合调和指数、耦合度和耦合协调度(表3)。综合评价结果显示：

将初代愈伤组织每隔20 d进行继代培养，继代3次后，将状态良好大小一致的愈伤组织转接到分化培养基上进行分化培养。分化培养30 d后进行数据统计。

1.2.4培养条件

诱导及继代培养：25 ℃，暗培养。

分化培养：25 ℃，光照16 h/d，光照强度2 000 lx。

1.2.5统计方法

诱导率(%)=出愈数/接种的纵切胚数×100%；

直接发芽率(%)=发芽数/接种的幼胚数×100%；

诱导率、分化率的方差分析采用SPPS 24.0的统计软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　不同浓度的2,4-D对大麦Morex幼胚愈伤组织诱导率的影响

从表4可以看出，2,4-D浓度为6 mg/L时，大麦Morex幼胚的愈伤组织诱导率最高。而且2,4-D浓度为6 mg/L时标准差和方差较低，说明数据波动小，代表性高。

表4不同浓度的2,4-D对大麦Morex幼胚的愈伤组织诱导率

2,4-D浓度(mg/L)平均出愈率(%)标准差方差245.285.09125.919350.828.02664.418455.557.08550.205559.722.0984.405676.112.9308.585766.114.74022.471

2.2　不同浓度的2,4-D对大麦Morex幼胚愈伤组织直接发芽率的影响

由图1可看出，6 mg/L的2,4-D诱导的大麦Morex幼胚愈伤组织较大。统计结果(表5)表明，2,4-D浓度为6 mg/L时，大麦Morex幼胚的愈伤组织直接发芽率最低，为7.22%。故选用6 mg/L的2,4-D浓度为不同碳源处理时的浓度。

表5大麦Morex幼胚在不同2,4-D浓度下的直接发芽率

2,4-D浓度(mg/L)芽数(个)直接发芽率(%)24011.1134211.6743710.2753610.006267.2274713.05

2.3　不同种类及不同浓度碳源对大麦Morex幼胚出愈率的影响

从表6可看出，在2,4-D浓度为6 g/L的条件下蔗糖浓度为40 g/L时，大麦Morex幼胚的出愈率最高；蔗糖加麦芽糖为30 g/L时愈伤组织诱导率也较高。

注：A为2,4-D浓度为2 mg/L时的大麦Morex幼胚愈伤组织(15 d)；B为2,4-D浓度为6 mg/L时的大麦Morex幼胚愈伤组织(15 d)。图1　大麦幼胚愈伤组织

表8不同浓度的激素配比的大麦Morex幼胚愈伤组织分化率

6-BA/IAA(mg/L)0.5/0.11/0.11.5/0.12/0.13/0.10.5/0.21/0.21.5/0.22/0.23/0.2分化率(%)62788186867754639195

表6不同种类及不同浓度碳源下大麦Morex幼胚的出愈率(%)

碳源20g/L30g/L40g/L50g/L60g/L蔗糖52.3341.6768.6730.6747.33葡萄糖54.3355.6751.6744.3344.67蔗糖+麦芽糖48.6764.0056.3348.6742.33

2.4　不同种类及不同浓度碳源对大麦Morex幼胚愈伤组织直接发芽率的影响

从表7可看出，愈伤组织直接发芽率最低的是葡萄糖浓度为20 g/L时的培养基；蔗糖浓度为50 g/L时愈伤组织直接发芽率最高。其中蔗糖浓度为40 g/L时，愈伤组织直接发芽率为11%，相对浓度为20 g/L和30 g/L较高；但是碳源浓度为20 g/L和30 g/L时，大麦Morex幼胚愈伤组织诱导率均较低，因此综合考虑选40 g/L的蔗糖浓度为碳源。

表7施加不同种类及不同浓度碳源大麦Morex幼胚愈伤组织直接发芽率(%)

碳源20g/L30g/L40g/L50g/L60g/L蔗糖6.337.0011.0027.6725.00葡萄糖5.6713.0015.6719.6726.67葡萄糖+麦芽糖9.337.6713.6717.6718.33

2.5　不同激素浓度配比对大麦Morex幼胚愈伤组织分化率的影响

图2是6-BA与IAA的浓度配比为(3∶0.2)mg/L时分化30 d后的大麦Morex幼胚愈伤组织；数据表明，6-BA与IAA的浓度配比为(3∶0.2)mg/L时，大麦Morex愈伤组织的分化率最高，其中6-BA的浓度是IAA浓度的20～30倍时，大麦Morex幼胚愈伤组织的分化率均较高。

图2　大麦Morex幼胚愈伤组织分化状态

3　讨论与结论

3.1　讨　论

本试验主要研究培养基成分中碳源及激素对大麦Morex幼胚愈伤组织的诱导及分化的影响。结果表明，大麦Morex幼胚诱导愈伤的最佳2,4-D浓度为6 mg/L；最佳的碳源为蔗糖，其浓度为40 g/L时诱导率最高；6-BA与IAA的浓度配比为(3∶0.2)mg/L时，愈伤组织的分化率均最高。影响大麦幼胚诱导愈伤组织和分化的因素有大麦的基因型、培养基的配方、接种方式、幼胚质量、幼胚胚龄等[4-5]。其中基因型是幼胚诱导愈伤组织的主要影响因子[6]，蓝庆、闫永荣等以美里黄金，甘啤4号，Golden promise等为材料研究大麦再生体系的建立以及转基因工程，他们的研究表明，大麦品种间的出愈率、愈伤组织的分化率均有显著差异，比如大麦Morex的出愈率高达94.95%，而短芒紫青稞的出愈率低于6%[7-19]。郭晓琳等的研究表明，种子纵切后接种出愈率显著高于横切[10]。因此本研究选用愈伤诱导率最高的大麦Morex的幼胚为材料，并采用纵切的方法将1个大麦Morex幼胚切成2块接入培养基。大麦Morex幼胚接种3 d后，愈伤组织开始形成，15 d后形成干燥的淡黄色密致愈伤组织。用SPSS 24.0软件中单因素ANOVA分析不同2,4-D浓度下大麦幼胚出愈率的差异显著性，分析结果如表9所示。

表9不同2,4-D浓度下大麦Morex幼胚出愈率的差异显著

方差分析平方和自由度均方F显著性组间1832.7655366.55312.4960.000组内352.0041229.334总计2184.76917

结果表明，大麦Morex幼胚在6种2,4-D浓度水平下的培养基上愈伤组织的诱导率差异性极显著(α<0.01)，不同浓度2,4-D对大麦Morex幼胚的愈伤诱导影响极大。任江萍等在大麦幼胚立体培养条件的建立中也提到，不同浓度2,4-D对大麦愈伤组织的诱导存在较大差异[11]。由图3可以看出，2,4-D浓度在2～6 mg/L之间时，出愈率随2,4-D的浓度升高而升高，2,4-D浓度在5～7 mg/L之间是大麦Morex幼胚愈伤诱导最佳的浓度范围。与任江萍的研究相比，结果差异较大，她认为2,4-D的浓度在1～2 mg/L时，愈伤诱导率较高，当由2 mg/L升到5 mg/L时愈伤诱导率则下降。这可能是大麦品种不同和接种的幼胚胚龄不同而造成的差异。

由图4可以看出，在2,4-D的浓度为6 mg/L时，发芽率最低，综合最高愈伤诱导率也是6 mg/L的2,4-D条件下诱导的，因此6 mg/L的2,4-D是诱导大麦Morex幼胚愈伤组织的最佳浓度。

图3　不同2,4-D浓度下的大麦Morex幼胚平均出愈率

图4　不同2,4-D浓度下的大麦Morex幼胚平均愈伤直接出芽率

图5　不同种类及不同浓度碳源下大麦Morex幼胚平均出愈率

图6　不同种类及不同浓度碳源下大麦Morex幼胚平均直接出芽率

表10单样本检验

碳源检验值 = 68.67t自由度显著性(双尾)平均值差值差值 95% 置信区间下限上限蔗糖+麦芽糖-4.46840.011-16.67000-27.0294-6.3106蔗糖-3.27440.031-20.53600-37.9498-3.1222

根据魏日凤对不同碳源对水稻成熟胚的影响研究表明，蔗糖与麦芽糖的配比对愈伤组织的诱导有重要影响[12]。因此本研究设计了葡萄糖、蔗糖和蔗糖与麦芽糖的配比进行研究。从图5可以看出，40 g/L的蔗糖大麦Morex幼胚愈伤诱导率最高，20 g/L蔗糖加10 g/L麦芽糖愈伤诱导率次之。从图6可以看出，20 g/L的葡萄糖愈伤组织直接出芽率最低，但是其对应的愈伤诱导率也比较低，蔗糖浓度为40 g/L的出芽率相对居中，20 g/L蔗糖加10 g/L麦芽糖出芽率则比40 g/L的蔗糖低。因此对20 g/L蔗糖加10 g/L麦芽糖的大麦Morex幼胚愈伤组织平均诱导率与最高的诱导率68.67%作差异显著性单样本T检验分析，结果如表10 所示。

在单个样本检验表中，显示了t统计量为-4.468，自由度DF为4，平均值差值为-16.67，其中t检验的显著性0.011小于显著性水平0.05，说明这两组数据存在显著差异。因此诱导大麦Morex幼胚产生愈伤组织最佳的碳源及浓度为40 g/L的蔗糖。

图7　不同激素配比下大麦愈伤组织分化率

在愈伤组织分化阶段，生长素与细胞分裂素的比例决定了分化的趋向，刘雷等研究发现，不同比例的ZT和IAA对愈伤组织分化出绿点的作用差别不明显[13]，很多研究的细胞分裂素一般都选用6-BA[14-16]。因此本研究选用的生长素为IAA，细胞分裂素为6-BA。图7为不同浓度的激素配比的大麦Morex愈伤组织分化率，6-BA与IAA的浓度配比为3/0.2时，大麦Morex幼胚愈伤组织的绿点率最高，其中6-BA的浓度是IAA浓度的20～30倍时，大麦Morex幼胚愈伤组织的分化率均较高。