酶解法制备臭鳜鱼蛋白水解液

王翠 吴倩 殷婷婷 徐芹芹 伍亚华

摘 要：该文以水解度为考察指标，采用中性酶对臭鳜鱼肉糜进行了蛋白质水解，然后对影响水解反应的因素如酶的添加量、酶解温度、pH和液固比进行了研究，确定了最佳工艺条件。结果表明，中性酶水解臭鳜鱼蛋白质的最佳条件为液固比（g：mL）为4 [∶]1，酶的添加量为3000U/g，pH6.0，水解温度35℃。该条件下酶解时间3h，臭鳜鱼肉蛋白质的水解度为32.9%。

关键词：臭鳜鱼；酶解；水解度

中图分类号 TS254.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）03-04-0071-3

Abstract：The degree of hydrolysis （DH） as the index of investigation，the protein hydrolysis of smelly mandarin fish was carried out by neutral enzyme，technologic parameters influencing reaction including enzyme amount， temperature， pH and liquid-solid ratio were studied using enzyme hydrolysis.The optimum technologic condition was confirmed. Result showed that the best conditions were determined as follows： liquid-solid ratio 3：1， enzyme dose 2400 U/g， pH 6.0， hydrolysis temperature 35℃ and hydrolysis time 3h. These conditions gave a hydrolysis degree of smelly mandarin fish of 32.9% .

Key words： Smelly manarin fish；Enzymatic hydrolysis；Degree of hydrolysis

臭鳜鱼（smelly manarin fish），又名腌鲜鳜鱼，是新鲜鳜鱼发酵后的产物，生“臭”熟香[1]，是最具代表性的徽菜之一。臭鳜鱼不但营养价值高，而且口感和风味独特[2]。目前关于臭鳜魚的研究较少，多为初加工及微生物发酵，而在精深加工方面的报道较少。

蛋白质水解后的产物中含有大量的多肽，实验表明，很多多肽具有良好的生物活性，如抗氧化性。目前，如何利用不同的蛋白资源开发功能多肽已成为研究热点之一[3]。为此，本文以臭鳜鱼为研究对象，以蛋白水解度为考察指标，采用酶解法制备臭鳜鱼蛋白水解液，以期为臭鳜鱼的精深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 新鲜鳜鱼，市购，去除内脏，洗净，臭豆腐均匀抹满全身，装入食品袋，冰箱冷藏7d，绞碎成鱼肉糜后备用。酸性蛋白酶（5万U/g）、碱性蛋白酶（10万U/g），无锡酶制剂厂；中性蛋白酶（5万U/g）、木瓜蛋白酶（80万U/g），南宁庞博生物工程有限公司。

1.1.2 主要设备 FA2204B电子分析天平，上海越平科技科技有限公司；PB-10pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；多功能食品粉碎机，上海海菱电器有限公司；DK-S28型电子恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质酶解液的制备工艺 称取一定鱼肉肉糜，异丙醇脱脂后，按比例加入一定量的去离子水，加热至某一的温度，调节pH值，加酶，搅拌，恒温条件下水解一定时间，转移至沸水中对酶灭活10min，离心过滤，取上清液，即为水解液。

1.2.2 蛋白水解度DH的测定 具体见参考文献[4]。计算公式如下：

[DH（%）=A1-A0A×100]

式中：A1为水解液中游离氨基态氮的含量；A0为水解前样液中氨基态氮的含量；A为鱼肉糜中总氮的含量。

原料蛋白液中总氮含量检测方法为凯氏定氮法，游离氨基态氮含量测定为甲醛滴定法[5]。

2 结果与分析

2.1 水解酶的选择 在预实验的基础之上，选择酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶作为蛋白质水解酶，结合这几种酶的最适工作范围，鱼肉糜与去离子水的液固比（g：mL）为3：1，45℃、酶的添加量为3000U/g，在适宜的pH条件下，水解3h，考察鱼肉蛋白水解度，结果见表1。由表1可知，这4种蛋白酶对臭鳜鱼肉糜的水解效果差别很大，其中，中性蛋白酶的水解效果最好，水解度可达31.1%，酸性蛋白酶次之，碱性蛋白酶的水解效果最差。因此，选择中性蛋白酶作为臭鳜鱼的蛋白水解酶进行单因素实验，从而最终确定最佳水解条件。

2.2 单因素实验 确定中性蛋白酶作为水解酶，分别研究酶的添加量、水解温度、pH、水解时间、液固比对水解效果的影响。

2.2.1 酶的添加量对水解效果的影响 鱼肉糜与去离子水的液固比（g：mL）为3[∶]1，45℃、pH7.0的条件下，改变酶的添加量，水解3h后，臭鳜鱼肉糜水解结果如表2所示。由表2可知，随着中性蛋白酶添加量的增加，臭鳜鱼肉糜水解度也随之增加。当酶的添加量为1500U/g时，水解度为17.1%，酶的添加量增加为3000U/g时，水解度快速增加到31.1%，此后，随着酶的添加量进一步增加，蛋白水解度增加趋缓。这可能是由于反应底物与水解酶的结合基本饱和的原因[6]。综合考虑，确定酶的添加量为3000U/g。

2.2.2 温度对水解效果的影响 鱼肉糜与去离子水的液固比（g：mL）为3[∶]1，酶的添加量为3000U/g，pH7.0的条件下，改变水解温度，水解3h后，臭鳜鱼肉糜水解结果如表3所示。由表3可知，在较低范围内，随着温度的升高，臭鳜鱼肉糜水解度也随之增加。当温度升高到45℃时，水解度为31.3%，此后，随着温度进一步上升，水解度反而下降。这是因为温度对酶催化活性的影响很大，在适温度范围内，酶活性强，酶促反应速度大。因为酶的本质是蛋白质，所以当温度升高到一定值后，酶的活性就要钝化，甚至完全失活。因此确定水解温度为45℃。

2.2.3 pH对水解效果的影响 鱼肉糜与去离子水的液固比（g：mL）为3∶1，酶的添加量为3000U/g，水解温度为45℃的条件下，改变pH，水解3h后，臭鳜鱼肉糜水解结果如表4所示。由表4可知，pH对水解反应影响很大，当pH为5时，水解度为30.3%，当pH为7时，水解度升高到最大值31.1%，此后，随着pH进一步增加，水解度快速下降。这是因为pH不但可以改变蛋白酶的构象，还会改变酶与反应底物之间的相互作用，导致酶对反应底物的催化反应收到影响。因此确定pH为7.0。

2.2.4 水解时间对水解效果的影响 鱼肉糜与去离子水的液固比（g：mL）为3∶1，酶的添加量为3000U/g，水解温度为45℃的条件下，pH7.0，改变水解时间，臭鳜鱼肉糜水解结果如表5所示。由表5可知，在较短的时间内，水解时间对水解度的影响较大，随着水解时间的延长，蛋白质水解度增加，当水解时间为3h时，水解度为30.9%，此后，随着水解时间的进一步延长，水解度增加缓慢。综合考虑，确定水解时间为3h。

2.2.5 液固比对水解效果的影响 酶的添加量为3000U/g，水解温度为45℃，pH7.0的条件下，改变鱼肉糜与去离子水的液固比（g：mL），水解3h，臭鳜鱼肉糜水解结果如表6所示。由表6可知，在较低的范围内，随着液固比的增加，蛋白质水解度也随之增加，液固比增加到3：1时，水解度为30.9%。当液固比进一步增加，則水解度降低。这是因为液固比过低，反应底物溶解不够，酶在体系中的扩散能力降低，过量的底物可能通过分子间的作用力与酶形成稳定的中间产物，抑制了酶与底物的结合，导致蛋白水解度降低[7]。液固比过高，尽管可以增加反应底物的溶解度，但酶的浓度也会降低，酶与反应底物结合困难，水解度降低。因此选择液固比为3[∶]1。

2.3 酶的水解反应条件优化 根据单因素试验结果，选择酶的添加量、温度、pH以及液固比进行四因素三水平L9（34）正交试验，具体因素水平见表7。具体实验结果见表8。

由极差分析可知，中性酶水解臭鳜鱼蛋白质的正交试验中，各因素影响主次顺序为：D（液固比）>B（温度）>A（酶的添加量）>C（pH），最佳工艺条件为D3B1A2C1。验证实验结果显示，在液固比（g：mL）为4∶1、中性酶的添加量为3000U/g、pH6.0、35℃条件下，水解3h后，臭鳜鱼肉蛋白质水解度为32.9%，优于其他实验结果。

3 结论

采用酶解法对臭鳜鱼肉糜进行蛋白质水解，选用中性酶，在液固比（g：mL）为4∶1、酶的添加量为3000U/g、pH6.0、35℃条件下，水解3h后，臭鳜鱼肉蛋白质水解度可达32.9%。

参考文献

[1]宋亚琼，闫晓明，丁之恩，等.基于模糊数学的臭鳜鱼的感官评定[J].中国酿造，2015，34（5）：123-126.

[2]罗靓芷，武俊瑞，刘佳艺，等.臭鳜鱼中优良乳酸菌的分离筛选与鉴定[J].食品与发酵工业，2013，39（10）：132-136.

[3]何健南.蛋白质水解物提高乳化体系稳定性的研究进展[J].黑龙江农业科学，2015（12）：177-181.

[4]厉望，靳挺，武玉学.带鱼蛋白酶解条件优化及酶解物抗氧性能[J].食品科学，2013，34（9）：234-239.

[5]郭兴风.蛋白质水解度的测定[J].中国油脂，2000，25（6）：176-177.

[6]郑宝东.食品酶学[M].南京：东南大学出版社，2006：89-90.

[7]周晓云.酶技术[M].北京：石油工业出版社，1995：21-22.

（责编：张宏民）