沉默STC2对裸鼠结肠癌模型中肝转移瘤形成情况及IL-10和VEGF表达水平的影响

龚立刚 王梦萍 刘文俊 李 菲 任 斌

（1武汉市第八医院病理科 湖北武汉 430010；2武汉市汉口医院病理科 湖北武汉 430012）

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织（WHO）报道，结直肠癌是男性第三位和女性第二位常见的恶性肿瘤［1］。结直肠癌肝转移是影响患者预后的主要因素之一，手术切除是其主要的有效干预手段，但未达20%的患者可有指征接受根治性肝切除术，大部分仅能进行姑息性治疗，其5年生存率低于 10%［2］。 斯钙素 2 （Stanniocalcin 2，STC2）是一种糖蛋白分泌激素，在诸如乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种恶性肿瘤中发现其明显高表达，且其高表达与肿瘤大小有关［3］。因此本研究利用慢病毒载体将shRNA转染入HCT116细胞以沉默STC2，构建沉默STC2的HCT116细胞系，建立结肠癌肝转移动物模型，分析STC2在结肠癌肝转移中的作用，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 6～8周龄的雄性 Balb/c裸鼠24只，体重 16～20 g，购自武汉市第八医院动物实验中心，均放置于SPF3级实验室饲养。

1.1.2 实验细胞 人结肠癌细胞HCT116，由武汉市第八医院病理科提供。

1.1.3 实验试剂 胎牛血清购自Hyclone公司；RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；McCoy 5A培养基购自GIBCO公司；胰蛋白酶（Trypsin）购自吉诺生物医药技术有限公司；琼脂糖 （Agarose）购自Biowest Agarose公司；高效真核转染试剂购自威格拉斯生物技术有限公司；双荧光报告测试系统（Dual-LuciferaseReporter Assay System）购自 Promega公司；DNA Marker DL 2000购自宝生物工程有限公司；限制性内切酶（KpnⅠ、Sal I等）购自Takara公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）购自Duchefa公司；DNA Marker DM8000购自全式金生物公司；dNTPs购自Takara公司；ExTaq DNA聚合酶购自Takara公司；Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司；甘氨酸、三羟甲基氨基乙烷（Tris）购自Amresco公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、苯甲基磺酰氟 （PMSF）购自Promega公司；二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇购自武汉天源生物技术有限公司；Revert AidTM First Strand cDNA synthesis kit（#K1622）购自Fermentas公司；PCR产物胶回收试剂盒购自Biospin公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；HRP显色试剂盒购自Millipore公司；Moncolonal Anti-STC2 antibody produced inmouse购自Sigma公司；Matrigel胶购自BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HCT116细胞的培养和传代 HCT116细胞用含10%FBS的1640培养基于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。在高倍镜下观察，取对数生长期的细胞，培养瓶内细胞密度达到80%～90%时，吸出原有旧培养基，用PBS缓冲液冲洗一遍后，加入含EDTA的胰酶消化细胞，旋转培养瓶使溶液覆盖整个细胞面，在高倍镜下观察细胞变圆后吸出胰酶，再加入培养液基终止消化。用移液管轻轻吹打培养基，使细胞团分散成单细胞悬液，并按照实验需要，接种2.5 mL细胞悬液于新的细胞培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，使细胞分布均匀，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。

1.2.2 慢病毒 （Lentivirus）介导的基因沉默及验证根据pLL3.7载体及STC2基因上的酶切位点，设计STC2敲降引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：lenti-STC2-F：TGTGGAGATGATCCATT TCATTCAAGAGATGAAAT GGATCATCTCCACTTTTTTC；lenti-STC2-R：TCGAGAAAAAAGTGGAG ATGATCCATTTCATCTCT TAGGTGAAATGGATCATCTCCACA。取pLL3.7-STC2 10 μL送上海美吉生物公司测序（正向、反向双向测序）。打开DNAStar软件中的Sequence程序，对测序结果进行分析。点击“File”中的“EnterSequence”导入测序结果，与NCBI网站上给出的STC2基因碱基序列进行对比。选择所测结果第40～50位碱基开始比对 （测序结果从第40～50位碱基开始比较稳定），结果提示测序结果与NCBI网站STC2的序列完全吻合。具体步骤：①实验组：200 μL无 血 清 DMEM 稀 释 10 μg pLL3.7-STC2+5 μg pMDLg-pRRE+5 μg VSVG+5 μg pRSV-Rev。 对照组：200 μL 无血清 DMEM 稀释 10 μg pLL3.7+5 μg pMDLg-pRRE+5 μg VSVG+5 μg pRSV-Rev。 ②100 μL无血清 DMEM 稀释 7.2 μL VigoFect。 ③5 min后，将①、②溶液混合，室温静止15 min。④将实验组和对照组250 μL质粒和脂质体混合物分别加入2盘10 cm皿的HCT116细胞的培养皿中，做好标记。⑤6～10 h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FBS（从此刻开始算时间）。⑥转染24 h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上，如未达到，重复上述实验。⑦48 h后将2个10 cm培养皿中的培养液转移至2个15 mL离心管中，1 000 g离心5 min后，将上清转移至2个新的15 mL离心管中，此时收获含病毒的上清2管（沉默组 pLL3.7-STC2、对照组 pLL3.7-Con，每组2管），置于4℃冰箱备用。48 h之内若观察细胞状态欠佳，可每孔加入1 mL的相应完全培养基。传代培养，得到稳定沉默STC2的HCT116细胞系（HCT116 pLL3.7-STC2、 HCT116 pLL3.7-Con）。

1.2.3 Western Blot验证沉默STC2效果 取6孔板中要收集的沉默STC2的细胞 （HCT116 pLL3.7-STC2、HCT116 pLL3.7-Con），去掉培养基，用预冷的PBS轻轻洗涤一遍，然后将液体去除干净。每孔样品中分别加入300 μL RIPA裂解缓冲液+3 μL NaVO3+3 μL PMSF+3 μL PIC，置于冰上裂解 1～2 h，裂解在摇床上进行。将6孔板内细胞碎片和裂解液转移至1.5 mL离心管中，10 000 g，4℃，离心15 min，取上清分装后于-80℃保存。临用前于10 000 g、4℃离心1 min取上清，用于Western Blot分析。采用Millipore的HRP显色试剂盒进行显色，用凝胶扫描分析系统（LAS4000mini luminescent image analyzer）扫描存图。

1.2.4 建立结肠癌肝转移动物模型 取雄性Balb/c裸鼠共 24 只，体重 16～20 g，6～8 周龄，随机分为实验组及对照组，每组各12只，分别以能稳定沉默STC2的细胞HCT116 pLL3.7-STC2及细胞HCT116 pLL3.7-Con应用脾脏注射并保留脾脏建立结肠癌肝转移动物模型。结肠癌肝转移动物模型参考文献方法［4］并做适当改进，将测定细胞浓度为2.5×107/mL的癌细胞悬液 （实验组和对照组分别使用HCT116 pLL3.7-STC2细胞和HCT116 pLL3.7-Con）0.2 mL（5×106个）缓慢注射于脾内，3～5 min 后见注射部位发白、肿胀后拔针，立即用酒精棉球按压针眼直至无活动性出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。将小鼠置入温箱中保暖，腹腔注射1%哌拉西林0.1 mL，苏醒后给予葡萄糖盐水饲养，继续在SPF3级实验室IVC内独立饲养。3 w后颈脱臼处死后立即剖腹，观察肝脏表面转移癌结节数目、大小、位置，双肺、大肠、小肠、肠系膜受累情况，有无腹腔淋巴结转移及腹水，将转移瘤用10%福尔马林固定后石蜡包埋，连续组织切片，后行HE染色，光镜下观察，以明确肝转移情况。双肺及小肠均进行病理学检查，以明确有无转移情况。

1.2.5 免疫组织化学方法检测转移灶中白介素-10和VEGF的表达 将石蜡切片放置于染色架上，放在65℃烘箱中烘片2 h，待冷却后脱蜡，然后将切片放入PBS中，在摇床上洗3次，每次5 min。在微波修复盒中配制少许的EDTA缓冲液，将切片放入其中，行微波修复，中火至缓冲液煮沸后断电，间隔10 min后使用低火至煮沸。自然冷却后使用PBS洗涤3次，每次5 min。将切片放置入3%过氧化氢溶液中，室温下避开光线孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的作用。再用PBS洗3次，每次5 min，甩干后用组画笔将组织圈起来，以防止之后步骤中组织上所孵育的液体流出，在组织上加适量的5%BSA然后封闭20 min。甩去BSA液，每张切片加入50 μL稀释的一抗，完全覆盖组织，在4℃环境里过夜。再用PBS洗3次，每次5 min。去除PBS液，每张切片加50～100 μL相应种属的二抗，在4℃环境里孵育50 min。PBS洗3次，每次5 min。然后去除PBS液，每张切片加50～100 μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜控制显色。观察显色完全后，使用蒸馏水或自来水冲洗，然后使用苏木素复染，1%盐酸短暂酒精分化数秒，用自来水冲洗，然后氨水返蓝，流水冲洗。切片经过梯度酒精（70%～100%）10 min一个梯度，脱水干燥，二甲苯透明10 min，中性树胶封固，镜下观察拍照。结果判定：根据IL-10和VEGF的分泌特点，阳性结果判定为细胞膜或细胞质中出现棕黄色颗粒，在400倍光学显微镜下观察，每张切片取10个视野，使用专业图像处理分析软件Imageproplus 6.0进行分析，计数每个视野积分光密度值（IOD），以平均值作为每张切片的阳性细胞积分光密度值。

1.3 统计学分析 本实验所有数据均采用SPSS 17.0软件进行分析。计数资料采用（n）表示，采用Fisher检验进行比较；计量资料采用（）表示，采用t检验进行比较。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 WesternBlot验证沉默 STC2结果HCT116pLL3.7-STC2细胞中STC2蛋白的表达量少于HCT116pLL3.7-Con，提示沉默STC2成功。见图1。

2.2 两组造模后肝脏转移瘤形成情况的比较 实验组肝转移瘤发生率为41.67%（5/12），对照组为91.67%（11/12），组间差异有统计学意义 （Fisher检验，P=0.027）。实验组肝转移瘤数量少于对照组（p＜0.05），两组肝转移瘤大小和肝脏重量的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

图1 Western Blot验证图

2.3 IL-10和VEGF在转移瘤组织中的表达情况两组肝转移瘤组织中IL-10的表达均为阳性，在肿瘤细胞胞质和细胞间质内可见有棕黄色染色颗粒，而在未出现转移灶的正常肝脏中未见棕黄色颗粒，见图2。实验组与对照组两组切片的阳性细胞积分光密度值分别为 （8 459.55±2 598.32）、（14 503.69±4 786.58）， 组间差异有统计学意义 （t=3.509，P=0.042）。两组转移瘤组织中VEGF的表达均为阳性，主要表达于细胞胞浆，实验组与对照组切片的阳性细胞积分光密度值分别为（11 219.22±3 046.39）、（20 602.19±5 150.73）， 组间差异有统计学意义 （t=4.958，P=0.031）。

3 讨 论

STC是一种最初在硬骨鱼中发现的糖蛋白激素，在鱼的腮和肠道中起到抑制钙摄取的作用，还能促进肾脏对磷酸盐的吸收。随后有研究发现，人和其它哺乳动物体内也存在STC，并且在肿瘤的发生发展中也有重要作用［3］。STC主要包括STC1和STC2两种，研究证实人STC2基因定位于人染色体5q35.1，其序列中组氨酸和半胱氨酸的排列非常独特，是区分其他STC的关键［5］。STC2广泛存在于人体多种组织细胞中，但主要集中于肾脏的肾小管与集合管的主细胞和α闰细胞中以及十二指肠、脑、子宫、卵巢等组织中［5-7］。 已有研究显示［6-8］，STC2 的不同表达水平对多种恶性肿瘤的进展预测、转移、预后以等方面有一定的指导意义。Ieta［9］等通过基因芯片及qRT-PCR的方法检测了139例结直肠癌患者癌组织与癌旁正常组织中STC2的表达水平发现，结直肠癌患者中STC2的表达水平高于癌旁正常组织，其与淋巴结转移、肿瘤浸润深度、肿瘤大小及AJCC分期有关，且STC2高表达的患者其总体生存率也低于低表达组。Hashemzadeh等［10］研究结果也表明，结直肠癌患者中STC2的表达水平比癌旁正常组织高，并且STC2的表达水平与肿瘤大小和病理分级有关。在本研究中，实验组肝转移率和肝转移瘤数量少于对照组的结果，则提示了沉默STC2后结肠癌细胞肝转移能力的下降。

表1 两组肝脏转移瘤形成情况的比较（）

表1 两组肝脏转移瘤形成情况的比较（）

观察指标 实验组（n=12） 对照组（n=12） t P肝转移瘤数目/个 5.41±1.16 10.91±2.18 7.043 0.032肝转移瘤体积/cm3 0.05±0.01 0.04±0.02 1.414 0.283肝脏重量/g 1.53±0.12 1.59±0.14 1.528 0.261

IL-10作为一种具有抗炎作用的抑制性细胞因子，广泛参与调节免疫细胞的生长和分化，抑制T细胞的杀伤功能，对IL-12、IL-18等促炎因子的作用有拮抗效应，其所介导的抗炎反应将诱导免疫细胞对癌细胞的免疫耐受，在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用［11］。IL-10 在结肠癌组织中呈高表达［12］，术后患者血清中IL-10水平持续升高提示复发可能［13］，并且结肠癌患者血清中IL-10水平与预后有关，随着IL-10水平升高，患者发生肝转移的风险增加，癌细胞侵袭能力更强［14］。本研究中，实验组裸鼠肝脏IL-10的表达水平低于对照组，或与其抗炎作用及诱导免疫耐受能力减弱，令更多的癌细胞在肝脏局部免疫微环境的作用下被杀伤，从而导致聚集和形成肝转移灶减少有关。

肿瘤新生血管的形成是肿瘤侵袭和转移过程中的关键步骤之一。肿瘤细胞和宿主细胞的内皮细胞、上皮细胞及白细胞等都可以分泌释放多种细胞活性因子，这些细胞因子可以调控并促进肿瘤新生血管的形成，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的细胞因子之一。多种肿瘤细胞高表达VEGF，其生成的VEGF通过旁分泌的方式作用于内皮细胞上的VEGF受体，促进肿瘤血管增生并诱导新生血管形成，与多种恶性肿瘤的转移和预后有关［15］。在结肠癌中，VEGF和其受体的高表达与肝转移的发生有关，动物实验［16］研究结果表明稳定转染VEGF基因的结肠癌细胞增殖和转移能力明显升高。目前，在结直肠癌肝转移的治疗中，以贝伐单抗为代表的抗血管生成的药物主要集中于靶向VEGF及VEGF-R信号通路，通过阻断VEGF所介导的信号转导通路，抑制肿瘤新生血管的形成，有利于降低结肠癌细胞的增殖能力，一定程度上可改善不可切除的结直肠癌肝转移患者的预后［17］。本研究结果发现，沉默STC2后肝脏转移瘤VEGF表达水平低于未沉默者，与其肝转移潜能的下降相符。

图2 IL-10和VEGF在转移瘤组织中的表达情况（×400）

基于本研究，在裸鼠中将STC2沉默后结肠癌细胞的肝转移潜能下降，且其肝转移瘤中IL-10及VEGF的表达水平低于未沉默者，提示STC2或有望作为应用于结肠癌肝转移治疗的潜在治疗靶点之一。

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