抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备

靳晓瑞，吴 意，廖旻晶，邱义兰，唐 娜，曾林秀，王 平，郭向荣*，刘如石*

(湖南师范大学， a.医学院； b.第一附属医院； c.生命科学学院， 湖南 长沙 410013)

甲状腺是人体最大的内分泌腺，在机体中承担重要作用。分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在世界范围内逐年上升[1,2]。80%-90%的DTC患者通过甲状腺全切或者近全切手术、131I治疗和促甲状腺激素抑制可获得长期生存[3]。DTC患者约占甲状腺癌患者的90%，在初始治疗后10年内DTC肿瘤复发风险较高[4]。DTC患者预后总体较好，然而术后肿瘤复发率可达7%-30%[5]，严重影响患者的生存质量及预后[6]。因此，DTC的术后随访至关重要。除影像学检查外，临床医生还要通过肿瘤标志物检测进行动态监测，以便及时发现DTC肿瘤复发风险，进行早期干预和治疗[3]。由于Tg仅由良性甲状腺细胞或分化的恶性甲状腺细胞分泌，当DTC患者接受甲状腺全切或者近全切手术、131I治疗后，DTC细胞释放的Tg是血清Tg的唯一来源[7]。因此，Tg是分化型甲状腺癌治疗后随访的一个很好的肿瘤标志物[7-10]。血清Tg的测定有助于DTC患者的预后判断和监测治疗效果[11]。甲状腺球蛋白在临床上主要用于监测甲状腺全切或者近全切手术、131I治疗后是否有甲状腺组织的残留和是否复发[9-11]。临床上对DTC患者的随访发现，血清Tg含量的测定对于诊断DTC患者肿瘤复发或转移的灵敏度为88%-97%，特异性为100%[12]。

甲状腺球蛋白是由甲状腺滤泡上皮细胞分泌的一种660 kD糖蛋白二聚体，由两个相同的330 kD单体经二硫键连接构成，其主要生物学作用是促进甲状腺激素的碘化合成和合成后的存储。Tg基因位于人染色体8q24·2-8q24·3，基因组DNA由300 kb组成，编码2 767个氨基酸[13]。Tg主要在甲状腺滤泡细胞的内质网合成，经高尔基体加工后被分泌到滤泡腔，是滤泡腔内胶质的主要组成部分[2]。Tg进行大量修饰，包括糖基化、碘化和聚合，导致它在胶质中显著的异质性[14]。每个Tg约有2个甲状腺素(T4)和0.5个三碘甲腺原氨酸(T3)分子，储存在滤泡腔中[15]。在正常情况下，只有极微量的Tg进入血液循环。由于Tg仅由良性甲状腺细胞或分化的恶性甲状腺细胞分泌，因此在分化型甲状腺癌中，Tg升高多为肿瘤组织自身释放所致。甲状腺切除术后血清Tg水平仍较高，常提示肿瘤可能残余或转移[1,16]，对分化型甲状腺癌的治疗监测有重要临床意义。本课题的开展，将有助于今后国内自主制备抗人甲状腺球蛋白抗体，有效的降低了成本，具有重要的社会与经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞株

BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

天然人源甲状腺球蛋白(Tg)购自德国DIARECT公司；HRp-羊抗鼠二抗由厦门大学夏宁邵教授惠赠；蛋白质G亲和层析柱购自上海生工生物工程公司；蛋白质相对分子质量标准购自Thermo公司；BCA蛋白定量 试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购自美国GIBCO公司；HT和HAT以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为美国Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 天然Tg蛋白动物免疫

将Tg蛋白用pBS缓冲液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HpO4，2 mmol/L KH2pO4，pH 7.45)溶解并稀释至浓度为0.5 g/L，按1∶1(v/v)加入弗氏完全佐剂充分乳化。取5只8周龄BALB/c雌鼠做好标记，采用皮下多点注射免疫的方法，以每只小鼠100 μg的剂量进行初次免疫；第3周，将蛋白质溶液和弗式不完全佐剂按1∶1(v/v)混匀充分乳化，以同样剂量进行加强免疫。每间隔14 d进行一次加强免疫，一共进行三次免疫。具体免疫流程如表 1。

在每次免疫的前 1 d 收集小鼠血清进行间接 ELISA，检测小鼠血清中抗甲状腺球蛋白抗体效价。

1.2.2 间接ELISA检测小鼠免疫效价

Tg蛋白用pBS缓冲液(pH7.45)稀释至浓度为1 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；洗板1次，在吸水纸上扣干。加入封闭液200 μL。37 ℃封闭2 h；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入梯度稀释的小鼠血清，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入按1∶5 000稀释的酶标二抗GAM-IgG-HRp，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入TMB底物显色剂，每孔100 μL，37 ℃避光反应10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4终止显色反应，每孔50 μL。酶标仪波长450 nm进行检测。

表1 小鼠的抗原免疫程序

Tab.1 Antigen immunization program in mice

免疫周期Immunizingperiod天数Days/d佐剂Adjuvants免疫剂量Immunizingdose/μg免疫方式Immunemethod一免二免三免冲击免疫0142846弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂无100100100100多点皮下注射多点皮下注射多点皮下注射腹腔注射

1.2.3 细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆及亚型鉴定

选取血清效价最高的小鼠，在融合前4 d腹腔注射100 μg抗原进行冲击免疫。将生长状态良好的骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫后的小鼠脾脏细胞分别用无血清DMEM培养基洗涤3次后，经过计数后，以1∶5 ～ 1∶10混合，1 000 g离心10 min。离心后，将上清完全倒干净，将管底的细胞沉淀振动打散。在37 ℃水浴中，一边旋转轻轻摇动离心管，一边向混合细胞中逐滴加入1 mL 37 ℃预热的50% pEG 1 500溶液。随后加入预热的20 mL 10%FBS-DMEM完全培养基终止pEG作用。最后加入20% FBS-HAT-DMEM培养基重悬细胞并混匀。将混匀后的重悬细胞均匀接种于96孔板中，置于5% CO2，37 ℃培养箱中培养，每天跟踪观察。融合后7～10 d用10% FBS-HT-DMEM培养基换液。当克隆长至孔底面积的1/3～1/2时，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清抗体效价。通过有限稀释法对阳性值高且细胞集落数目少的孔进行亚克隆。经过4次亚克隆后，即得到能稳定分泌特异性抗甲状腺球蛋白抗体的杂交瘤细胞株，然后转移至24孔细胞培养板中扩大培养，再取细胞上清进行亚型鉴定。

1.2.4 单克隆抗体的亚型鉴定

Tg蛋白用pBS缓冲液(pH7.45)稀释至浓度为1 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃ 包被过夜或37 ℃ 2 h；洗板1次，在吸水纸上扣干。加入封闭液200 μL，37 ℃封闭2 h；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入杂交瘤细胞培养基上清，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入按1∶5 000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG1、羊抗鼠IgG2a、羊抗鼠IgG2b、羊抗鼠IgG3、羊抗鼠IgM和羊抗鼠IgG)，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入TMB底物显色剂，每孔100 μL，37 ℃避光反应10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4终止显色反应，每孔50 μL。酶标仪波长450 nm进行检测。

1.2.5 单克隆抗体的纯化

在接种杂交瘤细胞前1周，给8周龄BALB/c雄鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡。收集生长良好的杂交瘤细胞，调整细胞密度为2×106个细胞/mL，给每只小鼠腹腔注射0.5 mL细胞悬液。7～12 d后，待小鼠腹部明显膨大，抽取腹水。3 000 g离心10 min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，-20℃保存备用。将采集好的腹水缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，12 000 g离心10 min，沉淀用一定体积的pBS缓冲液(pH 7.45)溶解。12 000 g 4 ℃离心10 min，收集上清至透析袋中，随后将其透析平衡至20倍体积的结合缓冲液(0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HpO4，pH 7.4)中以除去高浓度的离子。透析后的单克隆抗体粗品进行蛋白质G亲和层析。加入5 mL结合缓冲液预先平和蛋白质G亲和柱，上样透析后的单克隆抗体粗制品1 mL，控制流速为1 mL/min，用25 mL结合缓冲液淋洗，随后用10 mL洗脱缓冲液(0.1 mol/L甘氨酸，pH 3.0)洗脱，收集亲和层析纯化后的抗体装于透析袋透析平衡至pBS缓冲液(pH 7.45)中。将小鼠原腹水与纯化后的抗体经SDS-pAGE电泳。

1.2.6 纯化后抗体的效价检测

将纯化后的抗体稀释至初始浓度为1 mg/mL，通过建立的间接ELISA检测方法对7株纯化后抗体进行效价检测。

1.2.7 单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

称取5 mg辣根过氧化物酶粉末溶解于0.5 mL双蒸水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL，混匀，4 ℃放置30 min。加入0.16 mol/L 乙二醇水溶液0.5 mL，室温放置30 min。加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 mL，混匀，并装入透析袋，放入碳酸盐缓冲液(0.03 mol/L NaHCO3，0.07 mol/L Na2CO3，pH 9.6)搅拌透析，4 ℃放置6 h(或过夜)，使之结合。加入新配的5 g/L NaBH4溶液0.2 mL，混匀，再4 ℃放置2 h。将上述溶液在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，混匀，4 ℃放置30 min，离心后去上清，沉淀用50%甘油重悬。一般5 mg蛋白用1 mL 50%甘油重悬。上述所得溶液即为酶结合物，分装后-20 ℃保存。

1.2.8 间接ELISA法测定HRp标记抗体效率

Tg蛋白用pBS缓冲液(pH7.45)稀释至浓度为1 μg/mL，作为抗原包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜或37 ℃ 2 h；洗板1次，在吸水纸上扣干。加入封闭液200 μL，37 ℃封闭2 h；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000稀释的HRp标记的抗体，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入TMB底物显色剂，每孔100 μL，37 ℃避光反应10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4终止显色反应，每孔50 μL,酶标仪波长450 nm进行检测。

根据生命周期理论，企业在发展过程中所处的阶段不同，在并购过程中，双方企业所处的经济环境和税收政策也会不同，为了制定出更加适应双方具体情况的筹划方案，需要使得税收筹划方案具有一定的灵活性，可以根据实际情况进行及时的调整，降低风险。

1.2.9 双抗体夹心ELISA法对不同抗体进行配对

捕获抗体用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至浓度为10 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；洗板1次，在吸水纸上扣干。加入封闭液200 μL，37 ℃封闭2 h；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入1 μg/mL Tg蛋白作为抗原，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入按1∶5 000 稀释的HRp标记的检测抗体，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。洗板5次，在吸水纸上扣干。加入TMB底物显色剂，每孔100 μL，37 ℃避光反应10 min。最后加入1 mol/L 的H2SO4终止显色反应，每孔50 μL。酶标仪波长450 nm进行检测。

1.2.10 双抗体夹心法的建立

1.2.10.1 双抗体夹心法的基本步骤

捕获抗体用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至浓度为10 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜； 洗板1次，扣干。加入封闭液200 μL，37 ℃封闭2 h；洗板5次，扣干。加入待测样品、阴性对照样品，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。洗板5次，扣干。加入HRp标记的检测抗体，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。洗板5次，扣干。加入TMB底物显色剂，每孔100 μL，37 ℃避光反应10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4终止显色反应，每孔50 μL。酶标仪波长450 nm进行检测。

1.2.10.2 捕获抗体的包被浓度和检测抗体的工作浓度的优化

按照棋盘滴定法设计实验方案，确定捕获抗体的包被浓度和检测抗体的工作浓度。将捕获抗体5F11按20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL的浓度依次包被酶标板。检测抗体12H8按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000的比例进行稀释。其他步骤同双抗体夹心法的基本步骤。

1.2.10.3 抗体夹心ELISA法检测灵敏度

以抗甲状腺球蛋白抗体5F11为捕获抗体10 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；洗板1次，在吸水纸上扣干。加入封闭液200 μL，37 ℃封闭2 h；洗板5次，在吸水纸上扣干。分别加入Tg蛋白浓度为1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入按1∶5 000 稀释的HRp标记抗甲状腺球蛋白抗体12H8，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板5次，在吸水纸上扣干。加入TMB底物显色剂，每孔100 μL，37 ℃避光反应10 min。最后加入1 mol/L的H2SO4终止显色反应，每孔50 μL，酶标仪波长450 nm进行检测。

1.2.10.4 双抗体夹心ELISA法检测临床血清样本

用确定的捕获抗体和HRp标记的检测抗体对标准品及临床样本进行检测。标准品是医院用甲状腺〗球蛋白检测试剂盒中定标液，稀释至浓度为500 ng/mL、250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.25 ng/mL、15.63 ng/mL、7.81 ng/mL、3.91 ng/mL、1.95 ng/mL、0.98 ng/mL。应用双抗夹心ELISA法检测，得到标准曲线，再将临床样本检测OD值带入标准曲线中，求检测值。将所求的检测值与医院中的临床值进行对比。临床血清样本于湖南省省肿瘤医院收集，该样本已用罗氏甲状腺球蛋白检测试剂盒检测，该检测值为临床值。比较检测值与临床值之间的差异，并对检测值与医院临床值相关性进行比较，评价配对抗体的实际应用价值。

2 结果与分析

2.1 间接ELISA小鼠免疫效价

通过间接ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价，阴性对照为未免疫小鼠血清，以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。小鼠在初次免疫后体内抗体水平较低，在第二次和第三次免疫后可以发现血清阳性值明显上升(图1)，说明Tg能在小鼠体内引起一定的免疫反应，作为抗原具有良好的免疫原性。在第三次免疫之后14 d，取血分离血清，倍比稀释后用间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价。结果如表2所示，4只小鼠效价均达 1∶400 000以上，达到细胞融合要求，可对小鼠进行冲击免疫后进行细胞融合。

图1 Tg免疫小鼠后，间接 ELISA 检测小鼠血清中抗体效价Fig.1 Antibody titers of mice detected by indirect ELISA after immunonized with Tg protein

表2 第三次免疫后小鼠血清的效价

Tab.2 Antibody titers of serum in mice after the third immunization

小鼠编号Nameofmouse小鼠血清稀释度Dilutionratioofseruminmice1：1001：10001：100001：1000001：2000001：4000001号小鼠2号小鼠3号小鼠4号小鼠阴性组小鼠2．0272．1502．0652．0940．0132．1022．1602．0732．0980．0202．1042．1652．0882．1130．0192．1701．7201．6131．9220．0831．8241．2951．0661．3380．0651．3470．7450．5430．6890．067

2.2 细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆及亚型鉴定

细胞融合10 d后，12块96孔细胞培养板的1 152个培养孔中有335个孔中长有葡萄样杂交瘤细胞集落。用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清抗Tg抗体效价，其中7孔为阳性。这7个孔通过有限稀释法分别进行亚克隆。经过4轮亚克隆，获得了7株能够稳定分泌抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1B5、5E1、5F11、5F12、6E5、9E3、12H8。

取细胞培养上清进行抗体亚型鉴定。以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。高于2.1倍阴性值 即为阳性值。亚型鉴定结果显示：除9E3细胞株抗体亚型为IgG2a外，其他6株细胞株亚型均为IgG1(图2)。

图2 单克隆抗体亚型鉴定Fig.2 Subtype identification of anti-Tg monoclonal antibodies

2.3 单克隆抗体的纯化与鉴定

注射杂交瘤细胞7～12 d小鼠腹水可形成，抽取腹水。腹水首先经50%硫酸铵沉淀初步纯化，然后用蛋白质G亲和层析柱纯化。以还原型的SDS-pAGE电泳分析纯化后的抗体，分离胶浓度为12%。在β-巯基乙醇的作用下，免疫球蛋白中的二硫键被破坏，重链与轻链分开。在还原型的SDS-pAGE电泳中，可见两条明显的条带(图3，lane 3)，重链约相对分子质量约为50 kD、轻链相对分子质量约为25 kD。与原腹水，纯化后的单抗没有其他明显的杂带，具有较高的纯度，可用来建立双抗体夹心ELISA方法。

lane M：预染色蛋白质相对分子质量标准；lane 1-7 亲和层析纯化后的7株单克隆抗体。lane M: prestained protein relative molecular standard; lane 1-2 Seven monoclonal antibodies purified by protein G affinity chromatography.图3 SDS-pAGE 鉴定亲和层析纯化后单克隆抗体的纯度Fig.3 SDS-pAGE analysis of monoclonal antibodies purity after purification by affinity chromatography

2.4 纯化后抗体的效价检测

通过建立的间接ELISA检测方法对7株纯化抗体进行效价检测。以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。高于2.1倍阴性值即为阳性值。检测结果如图 4和表 3所示：1B5、5E1、5F11纯化后抗体效价达到1∶3 200以上；5F12纯化后抗体效价达到1∶6 400 以上；6E5、9E3、12H8纯化后抗体效价达到1∶12 800以上。

图4 纯化后抗体效价的检测Fig.4 Detection antibody titers of the purified antibodies

表3 纯化抗体效价的检测结果

Tab.3 Antibody titers of the purified monoclonal antibodies

抗体编号Nameofantibody抗体稀释度Dilutionratioofantibodies1：4001：8001：16001：32001：64001：128001B55E15F115F126E59E312H8阴性对照1．9622．0782．0542．3092．3021．8822．1350．0141．7672．0831．8512．3342．1481．5951．8490．0281．2121．7480．9812．3112．2131．9921．7510．0300．6151．1100．6212．0642．1992．0090．7660．0150．1210．2270．1130．5292．1472．5921．1090．0160．1030．1110．0620．2301．7382．6420．4810．010

2.5 间接ELISA法测定HRp标记抗体效率

为建立Tg的双抗体夹心ELISA检测方法，利用经典的过碘酸钠法对纯化后的单克隆抗体进行标记，一步法检测酶标效果。以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。高于2.1倍阴性值即为阳性值。如图5所示，7株单克隆抗体均标记成功，HRp标记的单抗效价均为1∶5 000以上。在后续实验中HRp标记的单抗将作为检测抗体。

2.6 双抗体夹心法ELISA包被抗体与检测抗体的配对筛选

对不同的抗体采用双抗体夹心法ELISA进行配对筛选。将没有标记的纯化抗Tg蛋白单克隆抗体作为包被抗体，用来捕获样品中的Tg蛋白，HRp标记的抗Tg蛋白单克隆抗体用来作为检测抗体， 根据其与Tg蛋白的反应初步分析抗体配对情况。以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。高于2.1倍阴性值即为阳性值。结果如图 6所示，1B5与其他抗体的配对效果均较差；5E1可以和9E3、 12H8配对；5F11、5F12、6E5、9E3、12H8这5株抗体可以互相两两配对；最优配对是5F11为捕获抗体，12H8为检测抗体。在此基础上，我们将进一步使用捕获抗体5F11和检测抗体12H8建立Tg蛋白的双抗体夹心法检测技术。

图5 单克隆抗体标记效果分析Fig.5 Analysis of the effect of labelled monoclonal antibody with HRp

2.7 双抗体夹心 ELISA 法的建立

2.7.1 捕获抗体的包被浓度和检测抗体的工作浓度的优化

综合考虑节约成本和获得良好的检测效果两方面因素。捕获抗体包被浓度为10 μg/mL，检测抗体稀释比例为1∶4 000时，为最适工作条件(图7，表4)。

2.7.2 双抗体夹心ELISA法灵敏度的检测

筛选到配对抗体后，不同抗体对之间的特异性和灵敏度有较大差异。灵敏度较高的配对抗体在应用于临床样本的检测时更具有竞争优势。将Tg蛋白按不同浓度稀释后，双抗体夹心法能检测到的抗原浓度越低，说明配对抗体的灵敏度越高。以单抗5F11为捕获抗体，HRp标记的单抗12H8为检测抗体，不同浓度Tg蛋白为抗原进行双抗体夹心ELISA检测，以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。高于2.1倍阴性值即为阳性 值。本双抗体夹心ELISA法敏感性可达1 ng/mL(图8)。

图6 包被抗体与捕获抗体配对筛选Fig.6 paried screening of coated antibody and detection antibody

图7 最佳捕获抗体包被浓度和检测抗体工作浓度Fig.7 Optimization of working concentration for coating antibody and detection antibody

表4 最佳捕获抗体包被浓度和检测抗体工作浓度

Tab.4 Optimization of working concentration for coating antibody and dection antibody

检测抗体稀释度Dilutionofdetectionantibody包被抗体浓度Concentrationofcoatingantibody(μg/mL)201052．51．251：20001：40001：80001．0760．8660．3641．0540．9770．3140．9160．8540．3570．8150．6940．3280．6940．6530．258

图8 配对抗体灵敏度检测Fig.8 The sensitivity of detecting antibody paring

2.8 双抗体夹心ELISA 法检测临床血清样本

用最佳的捕获抗体与检测抗体对标准品和临床血清样本进行双抗体夹心法检测，得到标准曲线(图9)。以2.1倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值。高于2.1倍阴性值即为阳性值。将血清样本得到的OD值带入标准曲线的公式中，计算出本实验方法的检测值。将所得检测值与临床值进行比对。经过配对t检验，p>0.05，差异无统计学意义。线性回归分析得到相关系数R=0.986(图10)，可以认为临床值与检测值相关性较好。

图9 标准曲线的测定Fig.9 Determination of standard curve

图10 临床值与检测值的比较Fig.10 Comparison of clinical value and test value

3 讨论

临床检测血清Tg水平的方法有多种，如放射免疫分析法(radioiodine，RIA)、免疫量度分析法(immunometric assay，IMA)、电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，CLIA)等[17]。虽然各种检测方法技术已经很成熟并趋于规范化，但血清Tg水平检测结果因实验室、仪器、试剂以及检测方法的不同仍存在很大的差异，不具备良好的可比性[6]。Tg自身抗体(TgAb)对血清Tg水平的检测有很大的干扰，干扰与血清TgAb 的浓度不成正比，干扰程度与抗体的亲和力特异性有关[18]。血清TgAb阳性时，由于TgAb竞争抑制电化学发光免疫分析法试剂中的标记抗体，使得Tg测定值偏低，引起假阴性；用IMA法测定的Tg测定值偏低，引起假阴性；用RIA法Tg测定值偏高，引起假阳性[17]。Tg测定值的准确性由检测方法所使用抗体的特异性决定[19-21]。因此，获得高特异性、高灵敏度的单克隆抗体，对提高Tg测定方法的灵敏度尤其重要。

血清Tg水平的检测结果因方法间变异较大、批内精密度不够好、灵敏度不够高而存在很大差异。Tg的检测可能受到内源性的TgAb、异噬性抗体、高浓度的Tg的钩状效应等因素的干扰[22,23]。另外一些甲状腺肿瘤中甲状腺滤泡上皮细胞分泌Tg的过程改变导致其生化特征发生变化，使分泌的Tg具有独特的表位[24]。而实验室制备的抗体只能识别数量有限的表位，可能会引起血清Tg水平结果出现假阴性。

本研究采用天然人Tg蛋白经常规方法免疫小鼠、细胞融合、亚克隆，制备了7株抗人Tg单克隆抗体，建立了检测人血清Tg的双抗体夹心ELISA的方法，并对一些临床血清样本进行检测。目前抗人Tg单克隆抗体的制备还具有一定的技术难度，在很大程度上国内优质单抗依赖于进口，价格昂贵，限制了临床上Tg检测的推广使用。因此，本研究对建立完善的Tg定量检测技术，研发低成本检测试剂盒和打破对国外Tg单克隆抗体产品的依赖性具有一定意义。

[1] JUNG C K, LITTLE M p, LUBIN J H,etal. The increase in thyroid cancer incidence during the last four decades is accompanied by a high frequency of BRAF mutations and a sharp increase in RAS mutations[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2014, 99(2):276-285.

[2] XAVIER A C, MACIEL R M, VIEIRA J G,etal. Insights into the posttranslational structural heterogeneity of thyroglobulin and its role in the development, diagnosis, and management of benign and malignant thyroid diseases[J]. Archives of Endocrinology & Metabolism, 2016, 60(1):66.

[3] 丛慧, 李慧, 梁军, 等. 硒制剂对甲状腺球蛋白抗体阳性分化型甲状腺癌甲状腺球蛋白抗体水平的影响[J]. 中国医学科学院学报, 2015, 37(5):591-595.

CONG Hui, LI Hui, LIANG Jun,etal. Effect of selenious yeast tablets on the thyroglobulin antibody level in thyroglobulin antibody-positive patients with differentiated thyroid cancer[J].China Academic Journal, 2015, 37(5):591-595.

[4] 马艳红. 采用肿瘤标志物检测新手段提升甲状腺疾病管理水平[N]. 中国医药报, 2016-09-22 (003).

MA Yanhong. Detection of tumor markers to improving the management level of thyroid disease[N]. China pharmaceutical News, 2016-09-22 (003).

[5] TUTTLE R M, LEBOEUF R. Follow up approaches in thyroid cancer:a risk adapted paradigm[J]. Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 2008, 37(2):419-435.

[6] 王宗平, 伍波, 康杰, 等. 血清甲状腺球蛋白水平对分化型甲状腺癌的诊断和监测价值[J]. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(3):391-395.

WANG Zongping, WU Bo, KANG Jie,etal. Value of serum thyroglobulin in diagnosis and monitoring of differentiated thyroid cancer[J]. Chinese Journal of Bases and Clinics in General Surgery, 2017, 24(3):391-395.

[7] GIOVANELLA L, FELDTRASMUSSEN U, VERBURG F A,etal. Thyroglobulin measurement by highly sensitive assays:focus on laboratory challenges[J]. Clinical Chemistry & Laboratory Medicine, 2015, 53(9):1301.

[8] GREBE S K. Diagnosis and management of thyroid carcinoma:a focus on serum thyroglobulin[J]. Expert Review of Endocrinology & Metabolism, 2009, 4(4):25-43.

[9] COOpER D S, DOHERTY G M, HAUGEN B R,etal. Revised american thyroid association management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer[J]. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association, 2006, 16(1):109.

[10] pACINI F, SCHLUMBERGER M, DRALLE H,etal. European consensus for the management of patients with differentiated thyroid carcinoma of the follicular epithelium[J]. European Journal of Endocrinology, 2006, 154(6):787-803.

[11] 戴庆靖, 匡安仁. 甲状腺球蛋白测定的临床意义及影响因素[J]. 同位素, 2007, 20(2):120-124.

DAI Qingjing, KUANG Anren .The clinical application and interference factors of serum thyroglobulin measurement[J]. Journal of Isotopes, 2007, 20(2):120-124.

[12] SCULLY C. Oncology:a multidisciplinary textbook[J]. European Journal of Cancer, 1996, 73(5):711.

[13] GRAAF VDSAR, RIS-STALpERS C, pAUWS E,etal. Up to date with human thyroglobulin[J]. Journal of Endocrinology, 2001, 170(2):307-321.

[14] MARINO M, MCCLUSKEY R T. Role of thyroglobulin endocytic pathways in the control of thyroid hormone release[J]. American Journal of physiology-cell physiology, 2000, 279(5):295-306.

[15] LO G p, LI V V, COLACCHIO D,etal. Thyroglobulin production by thyroid cancers[J]. Journal of Surgical Research, 1978, 24(1):1-6.

[16] BRASSARD M, BORGET I, EDETSANSON A,etal. Long-term follow-up of patients with papillary and follicular thyroid cancer:a prospective study on 715 patients[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2011, 96(5):1352.

[17] SpENCER C A. Challenges of serum thyroglobulin (Tg) measurement in the presence of Tg autoantibodies[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2004, 89(8):3702-3704.

[18] 戴为信,白耀.甲状腺球蛋白的测定和临床[J]. 国外医学内分泌学分册, 2002, 22(6):364-366.

DAI Weixin, BAI Yao. Determination and clinical study of thyroglobulin[J]. Endocrinology Division of Foreign Medical Endocrinology Division, 2002, 22(6):364-366.

[19] CATUREGLI p, MARIOTTI S, KUppERS R C,etal. Epitopes on thyroglobulin:a study of patients with thyroid disease[J]. Autoimmunity, 1994, 18(1):41.

[20] pRENTICE L, KISO Y, FUKUMA N,etal. Monoclonal thyroglobulin autoantibodies:variable region analysis and epitope recognition[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80(3):977-986.

[21] SpENCER C A, WANG C C. Thyroglobulin measurement. Techniques, clinical benefits, and pitfalls[J]. Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 1995, 24(4):841.

[22] NAKABASHI C C, BISCOLLA R p, KASAMATSU T S,etal. Development, characterization and clinical validation of new sensitive immunofluorometric assay for the measurement of serum thyroglobulin[J]. Arquivos Brasileiros De Endocrinologia E Metabologia, 2012, 56(9):658.

[23] pREISSNER C M, O'KANE D J, SINGH R J,etal. phantoms in the assay tube:heterophile antibody interferences in serum thyroglobulin assays[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2003, 88(7):3069.

[24] SCHULZ R, BETHAUSER H, STEMpKA L,etal. Evidence for immunological differences between circulating and thyroid tissue-derived thyroglobulin in men[J]. European Journal of Clinical Investigation, 1989, 19(5):459-463.