睡眠剥夺对小鼠生长发育影响初探

张雅荃, 杨文静, 林丽芳, 阮文婕

(1. 复旦附属中学, 上海200433; 2. 海军军医大学动物中心, 上海 200433)

人一生中有三分之一的时间是在睡眠中度过，睡眠作为生命所必须的过程，是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，是健康不可缺少的组成部分。据中国睡眠研究会公布的最新睡眠调查结果，中国成年人失眠发生率为38.2%，远远高于国外发达国家[1]。在生活节奏日益加快、学习和工作压力的砝码不断飙升的今天, 人们面临越来越多的应激事件, 这种因生活、学习或工作、甚至疾病等因素使得人们的睡眠时间逐渐减少，睡眠质量严重降低,即睡眠剥夺[2]。大量研究[3-5]表明, 长期的睡眠剥夺会影响人类的健康，包括学习记忆能力、机体免疫功能等等，而目前国内外对于睡眠剥夺的研究主要集中在其对成年个体的神经系统、心血管系统和消化系统的影响。人类寿命长达百年之久, 可能由于时间跨度的限制以及伦理学的限制，目前缺乏关于睡眠剥夺对幼儿及青少年生长发育影响的研究。

青少年各项身体机能尚未发育成熟，其神经、免疫、骨骼、血液等各大系统正处于生长和功能完善的关键时期，青少年阶段也是人类初识社会，建立健全的人格、品格以及情绪控制能力的关键时期。这一阶段出现睡眠不足，是否会直接或间接影响整个机体的生长发育过程，甚至对成年后的身体机能留下隐患呢？本研究通过比较睡眠剥夺组和作息正常对照组小鼠生长等情况的差异，探索睡眠在青少年阶段生长过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

28日龄清洁级ICR小鼠48只，雌雄各半，由第二军医大学实验动物中心提供 [SCXK(沪)2012-0003]，常规饲养，每日光照从6∶00～18∶00，饲养环境温度22～25 ℃，自由摄食饮水[SYXK(沪)2012-0003]。

1.2 仪器及试剂

平台式小鼠睡眠剥夺仪(SA107，赛昂斯生物科技有限公司，中国江苏)、全自动血球仪(Siemensadvia2120, Siemens, 德国)、QPCR 仪(Stepone plus，ABI, 美国)、MicroCT全自动分析仪(GE Locus SP，美国)等。主要试剂有ELISA检测试剂盒, Trizol试剂, SYBGreenI(Takara, 日本)。

1.3 睡眠剥夺模型构建

28日龄小鼠正处于生长的关键时期，类似于人类的青少年阶段[4]。应用随机数字表将48只小鼠分为睡眠剥夺组和对照组各24只。实验小鼠采用改良的平台法进行睡眠剥夺处理(12∶00至次日上午8∶00)，通过设置参数控制小鼠所站立的平台随机移动，从而使小鼠无法进入睡眠状态，连续20 d。对照组小鼠单独笼饲养，按正常作息时间。

1.4 观测指标

1.4.1 体质量及部分血常规 每5 d称量记录小鼠体质量。实验前(0 d)和实验结束(20 d)采集各组小鼠眼眶静脉血20 μL至抗凝EP管中，用于检测白细胞数量(WBC)、红细胞数量(RBC)、血红蛋白含量(HGB)和红细胞压积(HCT)。

1.4.2 ELISA检测皮质酮等含量 从小鼠眼眶动静脉丛取血500 μL, 利用ELISA检测试剂盒, 参照试剂盒提供的标准操作流程进行皮质酮、生长激素、白介素-2(IL-2)血清含量测定。根据标准品绘制标准曲线, 然后根据样品吸光度(A)值推算相应的浓度。

1.4.3 qPCR检测皮质酮受体(GR)表达 实验前和实验结束分别从实验组和对照组取3只小鼠采集新鲜脾脏，于无RNA酶条件下使用组织总RNA提取试剂盒(RNAprep pure Tissue Kit，Tiangen, 中国)提取脾脏的总RNA。将提取的RNA于10 mg/L琼脂糖中跑胶，检测mRNA的含量。

按照反转录试剂盒(FastQuant RT Kit, Tiangen,中国)说明进行操作: 按照500 ng mRNA浓度以20 μL体系进行反转录：先加入DNA去除液(5×gDNA Buffer)，于42 ℃孵育3 min后，置冰上，后加入反转录酶及引物、缓冲液等(RT Enzyme Mix,10*Fast RT Buffer, FQ-RT Primer Mix)混匀后42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min后4 ℃保存。将mRNA反转录为cDNA。

使用Primer 5设计GR的引物序列(正向: 5'-GTGAACAGCACATGGGT GTTT-3', 反向: 5'-GGCAGAGTGAGGAGGGTACA-3')，以GAPDH作为内参基因，检测(GR的表达水平。使用SYBR Green Master Mix (Tiangen, 中国)进行实时定量PCR, 反应体系为: 95℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 72 ℃ 30 s，40 个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s，并用StepOne Plus 实时定量PCR检测系统进行检测。1.4.4 Micro CT检测骨量指标 实验结束，取双侧股骨放入Micro CT机(上海交通大学医学院附属瑞金医院)样本球管中，进行Micro CT扫描及三维结构重建。扫描完成后，采用配套软件分析其骨小梁三维微观结构并采集骨小梁的空间结构参数，以股骨干骺端上1.6 mm处作断层测定。检测指标包括: 小梁厚度，小梁数目，小梁间距，小梁骨密度，松质骨密度。

1.5 统计学方法

实验结果用±s表示，运用SPSS15.0软件进行统计学分析实验数据，采用Student’st检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 睡眠剥夺对小鼠体质量和部分血液学指标影响

对照组小鼠体质量以基本恒定的速率增长, 而实验组小鼠体质量在实验开始10 d内逐渐降低，随后逐渐开始增长，但始终低于对照组小鼠(表1)。实验组WBC、RBC、HGB和HCT均低于对照组(表2)。且实验组的WBC、RBC、HGB和HCT也均低于实验前(0 d)的水平。

2.2 睡眠剥夺对小鼠神经内分泌及免疫功能的影响

实验组小鼠血清生长激素、IL-2水平显著低于对照组, 皮质酮水平显著高于对照组(表3)。实验组小鼠皮质酮受体(GR)表达也显著高于对照组(图1)。

2.3 睡眠剥夺对小鼠骨骼生长的影响

从Micro CT三维结构重建图可以看出，与对照组小鼠比较，实验组小鼠股骨骨小梁结构完整性较差(图2A)。平扫图像与骨微结构数据显示(图2B～F)，与对照组比较，实验组小鼠骨小梁厚度减小(图2B)、数量少(图2C)、间距大(图2D)、小梁骨密度低(图2E)，骨松质密度也较低(图2F)。且实验组20 d后的各个骨骼生长的指标与实验前比较均有显著差异(图2B～F)。

表1 实验期间小鼠生长情况 g

表2 实验前后小鼠部分血液学指标

表3 小鼠血清中生长激素、皮质酮、IL-2水平

3 讨论

生长发育与人类进化繁衍息息相关。从全球范围看，改善生长发育状况是提高人类健康水平的重要因素。青少年的良好发育是提高全民族健康水平的基础，针对青少年生长发育的研究是造福后代的伟业。青少年的生长发育除了受到先天遗传的影响, 睡眠、营养、运动等后天因素也发挥重要作用,其中睡眠对于维持个体生存、促进生长发育、维持器官新陈代谢、形成记忆等方面意义重大。中国青少年研究中心新近发布统计数据[6]显示,2005～2015年，近六成青少年睡眠不足国家规定的9 h。因此，研究睡眠在青少年生长发育中的作用在是生命科学领域不可获取的重要课题。

图1 qPCR检测小鼠皮质酮受体表达水平(n=3)

图2 小鼠Micro CT扫描及骨微结构指标

本文利用幼年小鼠进行了20 d的睡眠剥夺实验和系统性的观察，表明睡眠剥夺后严重影响了小鼠整体生长发育水平。小鼠体质量增长水平低于同期对照小鼠，实验结束时体质量比对照组小鼠少10 g左右; 红细胞及白细胞数量显著低于对照小鼠; 脾脏免疫细胞分泌的IL-2水平显著降低; 骨骼生长严重滞后，骨小梁密度低、骨小梁间距增大。研究[7]表明，只有在慢波睡眠时，大脑内垂体才会大量分泌生长激素，以维持机体的生长、器官发育及损伤修复以及骨骼的生长。本文检测结果证实，睡眠剥夺小鼠体内生长激素分泌水平显著低于正常小鼠。生长激素分泌不足，影响发育期小鼠骨骼的生长，势必会对成年后小鼠的运动能力及老年后的骨质能力造成潜在的危害。而对于机体主要脏器系统而言，血细胞数量产生不足以及免疫器官发育不全将直接导致小鼠免疫能力显著降低，间接影响小鼠成年后的生活质量、抗病能力以及寿命。此外，睡眠剥夺会通过下调海马中的海马磷酸化环磷酸腺苷相应元件结合蛋白(pCREB)水平削弱机体的空间学习、长期记忆等脑认知功能[8,9]。这就说明，睡眠剥夺短期内会影响小鼠的体格生长发育，长远看来会对机体的健康及学习记忆能力造成损害。该结果与朱寅秋等的大鼠研究结果一致[10]。

此外，睡眠剥夺对幼年小鼠来说也是一项重要的应激源。应激反应的最重要特征是下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)激活及由此引起糖皮质类固醇等激素分泌增加[11,12]。HPA神经内分泌系统所分泌的激素会直接影响动物的情绪及行为表型[13]。本研究表明，睡眠剥夺导致小鼠的糖皮质激素水平显著升高，说明睡眠剥夺引起小鼠HPA轴激活。皮质醇及其受体在应激反应中有着重要的作用，过量的皮质醇会引起血压升高、代谢增强、神经系统警戒性增高等反应，虽然可以一过性提高机体对外界刺激的防御能力，但是大量的皮质醇还会影响葡萄糖的摄取，干扰细胞的代谢，降低细胞的生存能力，严重时会导致机体的多个器官功能受损甚至会引起大脑的器质性损害[14-16]。高水平的皮质醇和低浓度的生长激素共同导致了小鼠器官发育迟缓以及机体生长速度降低。长达20 d的慢性睡眠剥夺已经严重透支机体免疫系统的功能，脾脏出现功能性损伤，从而导致血清中IL-2水平显著降低，进一步会导致机体对致病微生物抵抗能力的崩溃。

本项研究表明，睡眠不足影响机体主要脏器和系统的正常生长发育，对小鼠整体的免疫功能和神经系统功能等造成潜在的损害，影响成年后的生理机能。然而，对于青少年而言，其所处的阶段是体格和智力发育的关键时期，这一阶段的睡眠质量会直接影响其当前和未来的身体素质和智力水平，因此保障青少年群体的睡眠质量尤为重要。

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