大鼠放射性心脏损伤机制的比较医学意义

马金柯, 高世乐, 胡宗涛, 王 崇, 高 杉, 董六一, 刘 阳, 唐正中

(1. 解放军第105医院放疗中心, 合肥 230031;2. 解放军第105医院肿瘤三科, 合肥 230031;3.安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032）

由于胸部及纵隔肿瘤的发病率呈上升趋势，确诊时多失去手术机会或根据临床分期需要术后辅助放疗，越来越多的患者接受放射治疗[1]。胸部肿瘤放射治疗的同时常引起放射性心脏损伤(radiation induced heart disease，RIHD)，如放射性心包炎、心肌纤维化、冠状动脉损伤、瓣膜纤维化、心脏传导系统损伤等[2,3]; 轻者临床症状不明显，重者可有发热、心悸、气短、胸闷、胸痛，伴心脏杂音、心律失常、颈静脉怒张、窦性心动过速等体征。已有研究[4]报道，放射治疗除了可以通过电离辐射对肿瘤组织产生治疗作用外，同时增加患者治疗期间或治疗后罹患心包疾病、冠心病、心脏瓣膜疾病、充血性心力衰竭、猝死等疾病的风险，目前尚无有效应对方法，重在预防。因此，建立大鼠RIHD动物实验模型，研究相关标志物变化，初步探讨可靠的评价标准，为临床早期诊断、发现和治疗，提供重要的基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠90只, 5～6周龄，体质量(200 ± 25) g，由安徽医科大学实验动物中心提供[SCXK(皖)2015-007]，饲养于安徽医科大学实验动物中心[SYXK(皖)2015-007]，温度(20 ± 2) ℃，相对湿度50% ± 10%，适应性饲养1周后实验。

1.2 实验仪器

VARIN21-EX直线加速器(美国瓦里安医疗器械公司); 同步六导联心电图机(光电8420K，日本光电公司); GEGE Vivid 7超声心动图; SPECTRA MAX 190型酶标仪(美国Molecular De-vices公司)等。

1.3 动物分组与模型制备

将90只SD雄性大鼠随机分为正常对照组和5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy 四个不同剂量照射组, 每组18只。所有实验动物饲养1周后, 照射前晚禁食禁水8 h, 称重后给予体积分数10%水合氯醛0.35 mL/100g腹腔注射麻醉, 取仰卧位, 头部及四肢固定在鼠板上，模拟机定位下确定大鼠心脏轮廓。正常对照组只麻醉, 不照射; 照射组分别给予6 MV X线5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy四个不同剂量单次照射, 靶区面积(2～2.5) cm×(2～2.5) cm,源皮距100 cm, 剂量率4 Gy/min。照射结束待大鼠苏醒后送回动物房，整个过程无动物死亡。

1.4 指标检测

1.4.1 超声指标检测 于造模后2周、4周、12周末分批处死大鼠，每次每组6只，体积分数10%水合氯醛0.35 mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉生效后，取左侧卧位，剔净胸部毛，表面涂耦合剂，将GE 3S相控阵探头放置于左胸前，调整深度为2.0～2.5 cm，测量并记录左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室收缩压(left venteicular systolic pressuer，LVSP)及左心室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)等指标[5,6]。

1.4.2 心电图描记[7]超声检测完毕后，用针电极刺入四肢及胸壁皮下，心电图记录6个导联Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF，3个胸导联Va、Vb、Vc，胸导联Va置于胸骨中点右缘，Vc置于胸骨下1/3水平线与左腋前线交点，Vb置于两者交点，纸速为50 mm/s，定准电压1 mV=10 mm。按标准化法测量心电参数，记录心率(heart rate，HR)，S T波，T波等。

1.4.3 血清标志物检测 开胸后腹主动脉取血，置于常温下3 000 r/min离心20 min, 取上清液，按照酶联免疫试剂盒说明书，测得大鼠血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CKMB)、心肌肌钙蛋白I(cardiactroponin I，cTnI)吸光度值[8]。1.4.4 心重指数测定[9]取出大鼠心脏，除去大血管和心脏外膜等脂肪组织后用生理盐水清洗，吸干后称全心质量并记录，计算心重指数(HW/BW)。

1.5 统计学方法

用SPSS18.0统计分析软件进行处理，实验数据以±s表示，组间数据采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

模型组大鼠放疗后逐渐出现厌食, 活动量减少,精神差, 体质量增加缓慢，2周后照射组大鼠体表可见脱毛，表面皮肤先破溃，后结痂，未见明显感染，单次照射剂量越大，上述症状越明显, 8周后相关症状逐渐减轻; 正常对照组大鼠饮食、活动、精神状态正常，各组大鼠均无死亡(图1)。

2.2 心脏超声检查

与正常对照组相比，照射组(5 Gy、10 Gy、20 Gy)大鼠LVEF、LVSP测得值随照射剂量增加逐渐下降(P＜0.05或P＜0.01)，并呈负相关。LVEDP测得值随照射剂量增加逐渐增加(P＜0.05或P＜0.01),呈正相关。照射组间比较，LVEF、LVSP测得值在5 Gy、10 Gy组较20 Gy组逐渐降低，LVEDP测得值逐渐增加(P＜0.05或P＜0.01)。时间分布上，照射组LVEF、LVSP测得值在4周较2周和12周高，LVEDP测得值在4周较2周和12周低，分别在4周达到峰值和谷值 (图2，表1)。

图1 大鼠放疗前、放疗中、放疗后背部被毛变化

图2 大鼠放疗前、放疗后心脏超声变化

表1 各组大鼠LVEF、LVSP、LVEDP不同时间变化

2.3 心电图变化

与正常对照组相比, 照射各剂量组大鼠随着照射剂量增加, HR较正常组逐渐加快(P＜0.05或P＜0.01);照射组间比较, 5 Gy、10 Gy组较20 Gy组HR明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。时间分布上，各照射组在4周HR加快达到峰值，12周开始下降，ST段在4周抬高值达到峰值，12周开始呈下降趋势(图 3、表 2)。

2.4 血清标志物变化

同正常对照组比较，各照射组CKMB及cTnI测得值随着照射剂量增加，逐渐升高(P＜0.05或P＜0.01); 各照射组之间比较，CKMB及cTnI测得值在5 Gy组、10 Gy组较20 Gy组降低(P＜0.05或P＜0.01)，30 Gy 组与20 Gy组比较，呈下降趋势。时间分布上，CKMB及cTnI测得值在4周升高达峰值，12周逐渐降低(表3)。

图3 放疗前后大鼠心电图变化

表2 各组大鼠不同时间心电图变化

表3 各组大鼠血清CKMB、cTnI不同时间变化

2.5 大鼠体质量与心重指数变化

与正常对照组相比, 照射组大鼠体质量随着照射剂量增加，测得值逐渐减小，心重指数测得值逐渐增加(P＜0.05或P＜0.01); 照射组间比较，5 Gy组、10 Gy组同20 Gy组相比逐渐减少，心重指数测得值逐渐增加(P＜0.05或P＜0.01)。时间分布上，大鼠体质量测得值在12周达峰值，心重指数测得值在4周最低(表4)。

表4 各组大鼠心重指数不同时间变化

3 讨论

RIHD指心脏受到一次照射剂量达到10 Gy或短时间(数日)内受到分次局部外照射累及剂量达到45 Gy引起的损伤。1897年, 有学者[10,11]报道，放射线可造成心脏损伤，但因RIHD常处于亚临床状态，需经过相当长潜伏期才出现临床表现，并且认为心脏可以抵消放射线的损害，故未引起临床足够重视。1924年Davis[12]通过犬实验证实放射线的确可造成RIHD，且随着胸部肿瘤患者放疗的增加，RIHD逐渐成为肿瘤科常见放疗毒副反应, 目前认为, 仅可预防, 无有效治疗方法。因此, 研究RIHD的发生、临床表现、发病机制及诊断治疗成为临床医师研究的热点。

近年来，关于RIHD动物模型的建立及其发病机制和放疗后病理改变的研究越来越多，但目前尚无标准的放疗靶区勾画、剂量选择和评判标准。本课题组通过实验动物造模，模拟机定位下SD雄性大鼠照射组全心接受5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy四个不同剂量照射，并根据射野定位正常组织挡铅防护，照射后2～12周超声心动图、心电图、血清CKMB及cTnI测得值变化规律，判断RIHD的发生条件及相关指标在不同时间点的变化规律。通常认为，大鼠受照射后首先损伤心肌细胞间毛细血管内皮，进一步引起血管炎症、冠状动脉粥样硬化，心脏冠脉供血减少等一系列病理变化，为RIHD发生的共同病理过程。

本实验通过大鼠模型制备观察可以得出，照射组大鼠放疗后逐渐出现厌食、精神差、活动量减少、脱毛等表现，第8周之后相关症状逐渐减轻，正常对照组无此变化。超声心动图检查提示，与正常对照组相比，照射组大鼠LVEF、LVSP测得值变化与正常对照组相比，随着剂量增加，测得值逐渐减少, 30 Gy组同20 Gy组未见明显变化, 这一点与文献报道一致[13], 说明20 Gy以后增加照射剂量，没有增加损伤程度; 而LVEDP测得值随着照射剂量增加逐渐增加。LVEF、LVSP、LVEDP等指标可反映大鼠心脏功能，LVEF、LVSP值越大, LVEDP值越小, 表明大鼠心脏功能越好[14,15]。心电图是判断大鼠造模是否成功的常用指标之一，有文献[16]报道，在急性放射性心脏损伤中，心电图异常最为常见，主要以ST段改变和窦性心动过速为主。本实验照射组大鼠HR及ST段抬高值，随照射剂量逐渐增加而增加。血清标志物CKMB及cTnI是反映心肌急性损伤的敏感指标，心肌细胞损伤后，CKMB 和cTnI释放入血，血清浓度增加，且血清升高的浓度与心肌受损程度呈正相关性，可作为心肌损伤的判定标志物[17]。本实验中实验大鼠造模后血清CKMB及cTnI水平逐渐升高，且与照射剂量增加呈相关性。

综上所述，表明单次剂量照射大鼠全心，放疗至4周，RIHD产生，自5 Gy、10 Gy、20 Gy依次增加照射剂量, RIHD程度逐渐加重，30 Gy较20 Gy增加放疗剂量未增加放疗毒性，因此20 Gy可作为RIHD的造模参考剂量，值得推广。此外，大鼠RIHD与心脏标本病理结构改变的关系如何，是本课题组下一步研究的方向之一。

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