不同稀酸制备革兰氏阳性增强基质(GEM)颗粒的比较

李鹏成， 张晓燕, 2， 乔绪稳， 郑其升， 侯继波

(1.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，国家兽用生物制品工程研究中心，江苏 南京 210014； 2. 山西运城农业职业技术学院，山西 运城 044000)

有研究基于革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)形成的非活性食品级外壳颗粒，研制了一种抗原展示系统[1]，即乳酸乳球菌外壳-蛋白锚定系统[2-3]。这种外壳颗粒被称之为革兰氏阳性增强基质(GEM)颗粒，其实就是细菌去除蛋白、核酸等物质后的一种球形肽聚糖基质骨架。GEM抗原展示系统，由食品级遗传元件组成，十分安全。此外，该系统不需要对抗原进行纯化，极大降低了制造成本，并可用于多种非蛋白源和蛋白源的抗原展示，是一种优异的抗原载运系统。目前，通过该系统研制的抗原在多个动物疾病模型中能够有效地激发机体的免疫保护，成功展示的有：肺炎链球菌保护性抗原SlrA[2]、疟原虫的保护性抗原MSA2[4]和鼠疫耶尔森菌保护性抗原LcrV[5]等。

GEM颗粒作为GEM抗原展示系统的重要组成部分，其质量直接影响抗原的展示效率。关于GEM的制备，国内外未见深入报道。本研究拟通过比较不同稀酸处理制备GEM颗粒的效果，优化GEM颗粒的制备条件，主要对不同浓度的同种稀酸以及不同稀酸处理制备GEM颗粒的得率(计数)、蛋白去除率(SDS-PAGE)、与锚钩蛋白(PA)的亲和活性(SDS-PAGE)进行比较。此外，本试验还拟对GEM颗粒4 ℃下的保存期和冷冻干燥后的保存期进行研究，以期为完善乳酸乳球菌外壳-蛋白锚定系统，尤其是制备高质量的GEM颗粒提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 乳酸乳球菌MG1363由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器 GM17液体培养基(葡萄糖5.00 g/L、植物蛋白胨5.00 g/L、聚蛋白胨5.00 g/L、牛肉膏2.50 g/L、酵母粉2.50 g/L、β-磷酸甘油二钠19.00 g/L、抗坏血酸0.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，加双蒸水至1 L，调节pH值为7.1，115 ℃高压灭菌备用)、盐酸(HCl)、硫酸(H2SO4)、三氯乙酸(TCA)均购自国药集团，戊二醛、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、过硫酸铵均购自南京生兴生物技术有限公司，蛋白分子量Marker购自Thermo Scientific公司，BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，YK-HELBER细菌计数板购自北京卓川电子科技有限公司，锚钩蛋白(PA)由本实验室克隆表达获得。

1.2 乳酸乳球菌MG1363培养

乳酸乳球菌MG1363划线接种GM17平板，30 ℃培养 16～20 h，挑取单菌落接种新鲜GM17培养基，30 ℃静止培养 16～20 h，备用。

1.3 不同稀酸处理制备GEM颗粒

新鲜扩大培养的乳酸乳球菌MG1363，12 000 r/min离心10 min，室温无菌离心，收集菌体，灭菌纯水洗涤1遍，然后用1/5体积0.200 0 mol/L、0.100 0 mol/L、0.050 0 mol/L、0.025 0 mol/L的HCl(pH=1)，1.200 0 mol/L、0.600 0 mol/L、0.300 0 mol/L、0.015 0 mol/L的TCA(pH=1)，0.100 0 mol/L、0.050 0 mol/L、0.025 0 mol/L、0.012 5 mol/L的H2SO4重悬(pH=1)，煮沸30 min，离心去酸液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，最后一次用1/10体积的PBS重悬计数，2.5×109个颗粒为1 U。

1.4 GEM颗粒蛋白质去除效率

将不同稀酸处理的GEM颗粒调整至同一基数，经SDS-PAGE定性分析。同时定量分析比较不同稀酸处理得到的GEM颗粒蛋白质去除效率，分别收集不同稀酸煮沸的上清液，12 000 r/min离心3 min，热酸处理后上清液的pH调至7左右，用BCA蛋白质检测试剂盒进行蛋白质浓度测定分析。

1.5 不同稀酸制备的GEM与PA锚定活性

为了对结合蛋白进行较为准确的定量分析，首先，分别将1 U的GEM颗粒和过量的PA在室温下孵育30 min，12 000 r/min离心5 min，收集沉淀，PBS洗涤2次，然后用10%的SDS高温煮沸结合后的沉淀，使蛋白从颗粒上解离下来，离心收集上清液进行定量分析。具体方法如下：取结合后的悬浮液200 μl，加750 μl PBS，50 μl 10% SDS，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，分离沉淀和上清液，取上清液用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，同时用1 ml PBS重悬沉淀，取重悬沉淀和解离上清液进行SDS-PAGE鉴定。

1.6 GEM透射电镜观察

对制备好的GEM颗粒进行离心并收集，3 000 r/min离心5 min，弃上清液后加入含2.5%戊二醛的PBS(0.1 mol/L，pH=7.2)，4 ℃固定2 h，PBS漂洗3次，每次10 min，依次以30.0%、50.0%、75.0%、95.0%的乙醇脱水1次，1次10 min，然后以无水乙醇重复脱水2次，1次10 min，再用50.0%、70.0%、90.0%、100.0%的乙酸异戊酯逐级取代乙醇，每级置换2 min。二甲苯透明，将GEM颗粒完全浸没于盛有二甲苯的带盖小瓶中，1∶1(体积比)浸透，环氧树脂Epon812浸蜡，将浸好的透明GEM颗粒放入盛有环氧树脂Epon812的容器中20 min，环氧树脂Epon812包埋，将浸好蜡的GEM颗粒放于盛有环氧树脂Epon812的包埋器中，注入包埋剂，将组织块完全浸没，再将包埋器置于37 ℃温箱中24 h，超薄切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染，最后在Model S-3000N型透射显微镜下观察，拍照。

1.7 GEM颗粒4 ℃保存期试验

分别对4 ℃下保存0个月、2个月、6个月、12个月、15个月、18个月的GEM颗粒进行计数，比较不同保存时间下GEM的颗粒数，同时比较不同样品的锚定活性。

1.8 真空冷冻干燥对GEM颗粒锚定活性的影响

真空冷冻干燥GEM颗粒，观察其外观形态，拍照。同时，将冻干样品直接加入到PA溶液中，室温孵育30 min，通过SDS-PAGE分析检验冷冻干燥对GEM颗粒锚定活性的影响。

此外，本试验将冷冻干燥后的GEM颗粒置于37 ℃下进行耐老化试验，通过其蛋白锚定活性来监测冷冻干燥后GEM颗粒的保存期。

1.9 数据分析

GEM颗粒得率=(GEM颗粒数/原细菌数)×100%。数据采用SPSS(16.0)软件进行统计，差异显著性检验采用独立样本t检验和单因素方差分析。所有数据均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同稀酸处理GEM颗粒沉降出现的时间

不同稀酸的作用方式不同，不同浓度的同一种稀酸其作用强度也不同，因此，GEM制备过程中不同稀酸及不同浓度的同种稀酸处理，在煮沸过程中GEM颗粒的沉降速度不同，制备后成品悬浮液的澄清度也不同。图1显示，清水对照在煮沸细菌的整个过程中均未出现沉降，一直处于混悬液状态。当用稀酸煮沸时，则出现不同程度的沉降，其中，TCA处理沉降出现的最快，5 min左右出现，HCl处理次之，15 min左右出现沉降，H2SO4处理出现沉降最迟，20 min后才出现。

0：H2O；1：0.05 mol/L硫酸(H2SO4)；2：0.10 mol/L盐酸(HCl)；3：0.60 mol/L三氯乙酸(TCA)。图1 不同稀酸制备GEM颗粒的观察结果Fig.1 Observation of gram-positive enhancer matrix (GEM) particles prepared with different dilute acids

2.2 不同稀酸处理制备GEM颗粒的SDS-PAGE分析

图2和图3显示，MG1363主要的菌体蛋白质位于50 000左右，H2SO4和HCl处理制备的GEM颗粒随酸浓度的增加，50 000左右的菌体蛋白质逐渐减少，蛋白质去除效果越来越好。不同浓度TCA处理的蛋白质去除效果无明显差异，而且其蛋白质去除效果不及H2SO4处理和HCl处理。不同稀酸处理制备GEM颗粒去除蛋白质定量分析结果与SDS-PAGE分析结果一致。

M：蛋白质分子量标准；1：乳酸乳球菌MG1363；2：H2O处理(CK)；3：0.012 5 mol/L H2SO4处理；4：0.025 0 mol/L H2SO4处理；5：0.050 0 mol/L H2SO4处理；6：0.100 0 mol/L H2SO4处理。图2 不同浓度H2SO4制备GEM颗粒SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE assay of GEM particles prepared with different concentrations of H2SO4

M：蛋白质分子量标准；1：乳酸乳球菌MG1363；2：0.150 mol/L TCA处理；3：0.300 mol/L TCA处理；4：0.600 mol/L TCA处理；5：1.200 mol/L TCA处理；6：0.025 mol/L HCl处理；7：0.050 mol/L HCl处理；8：0.100 mol/L HCl处理；9：0.200 mol/L HCl处理。图3 不同浓度TCA和HCl制备GEM颗粒SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE assay of GEM particles prepared with different concentrations of TCA and HCl

2.3 不同稀酸处理制备GEM颗粒得率

随HCl浓度增加，GEM颗粒得率降低，而TCA浓度变化对GEM颗粒得率的影响不明显。中浓度和低浓度HCl处理的GEM颗粒得率高于H2SO4处理和TCA处理，1 ml菌液最高可以制备约3 U GEM颗粒(表1)。

2.4 不同稀酸制备的GEM与PA锚定的活性

图4显示，低浓度H2SO4处理(3泳道)制备的GEM与PA锚定效果不如中浓度处理(4泳道)和高浓度处理(5泳道、6泳道)制备的，中浓度H2SO4处理的GEM与PA锚定效果与高浓度处理的无明显差异。中浓度H2SO4处理(4泳道)和高浓度H2SO4处理(5泳道、6泳道)制备的GEM与PA锚定效果稍优于中浓度HCl处理(7泳道、8泳道)制备的。

低浓度TCA处理(2泳道)制备的GEM与PA锚定效果稍逊于中浓度处理(3泳道)和高浓度处理(4泳道、5泳道)制备的，中浓度处理的GEM与PA锚定效果与高浓度处理的无明显差异。HCl处理(6～9泳道)制备的GEM与PA锚定效果随HCl浓度增加逐渐增强。中浓度和高浓度TCA处理制备的GEM与中浓度和高浓度HCl处理制备的GEM与PA锚定活性无明显差异(图5)。

表1 不同稀酸制备的GEM颗粒得率

M：蛋白质分子量标准；1：锚钩蛋白PA；2：H2O处理(CK)；3：0.012 5mol/L H2SO4处理；4：0.025 0 mol/L H2SO4处理；5：0.050 0 mol/L H2SO4处理；6：0.100 0 mol/L H2SO4处理；7：0.050 0 mol/L HCl处理；8：0.100 0 mol/L HCl处理。图4 不同浓度H2SO4和HCl制备的GEM与PA锚定活性的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE assay of the anchoring activity between PA and GEM prepared with different concentrations of H2SO4 and HCl

M：蛋白质分子量标准；1：锚钩蛋白PA；2：0.150 mol/L TCA处理；3：0.300 mol/L TCA处理；4：0.600 mol/L TCA处理；5：1.200 mol/L TCA处理；6：0.025 mol/L HCl处理；7：0.050 mol/L HCl处理；8：0.100 mol/L HCl处理；9：0.200 mol/L HCl处理。图5 不同浓度TCA和HCl制备的GEM与PA锚定活性的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE assay of the anchoring activity between PA and GEM prepared with different concentrations of TCA and HCl

不同稀酸处理制备的GEM颗粒结合PA，经SDS解离后再经BCA蛋白质定量检测，其结果与SDS-PAGE分析结果一致。不同浓度H2SO4制备的1 U GEM颗粒结合PA的蛋白质质量分别为(128.1±5.7) μg(0.012 5 mol/L H2SO4)、(155.4±6.6) μg(0.025 0 mol/L H2SO4)、(158.3±3.2) μg(0.050 0 mol/L H2SO4)、(157.8±6.4) μg(0.100 0 mol/L H2SO4)，低浓度H2SO4处理制备的GEM结合PA活性较差，其他浓度处理制备的GEM间无明显差异。不同浓度TCA制备的1 U GEM颗粒结合PA的蛋白质质量分别为(116.4±4.5) μg(0.150 0 mol/L TCA)、(135.7±3.9) μg(0.300 0 mol/L TCA)、(138.3±3.6) μg(0.600 0 mol/L TCA)、(137.2±4.1) μg(1.200 0 mol/L TCA)，低浓度TCA处理制备的GEM结合PA活性较差，其他浓度处理制备的GEM间无明显差异。不同浓度HCl制备的1 U GEM颗粒结合PA的蛋白质质量随HCl浓度增加而增加，分别为(97.3±4.9) μg(0.025 0 mol/L HCl)、(125.7±7.2) μg(0.050 0 mol/L HCl)、(134.6±3.8) μg(0.100 0 mol/L HCl)、(137.9±5.3) μg (0.200 0 mol/L HCl)，中浓度和高浓度HCl处理制备的GEM与PA的结合活性显著高于低浓度HCl处理制备的(P<0.05)。所有中浓度、高浓度H2SO4、HCl、TCA处理的效果相近，差异不显著。

2.5 不同稀酸处理制备GEM颗粒电镜观察结果

GEM颗粒电镜观察结果(图6)显示，MG1363菌体本身，即细菌未经热酸煮沸之前，菌体内部核区可见大量的核酸，而且菌体内部各种蛋白质均有不同程度的负染着色。MG1363经热酸煮沸后，菌体内部着色均一，表明菌体内部的核酸及蛋白质均已被清除，HCl、H2SO4和TCA处理后的GEM颗粒电镜形态无明显差异。

A：MG1363菌体；B：0.10 mol/L HCl制备的GEM颗粒；C：0.05 mol/L H2SO4制备的GEM颗粒；D：0.60 mol/L TCA制备的GEM颗粒。图6 GEM颗粒透射电镜观察结果Fig.6 Transmission electron microscope images for GEM particles

2.6 4 ℃下GEM颗粒的保存期

对4 ℃下保存时间不同的GEM颗粒进行计数，均无明显变化。4 ℃下保存不同时间的GEM颗粒蛋白锚定活性均保持良好，各时间段的锚定活性无明显差异(图7)。

SDS解离后定量分析结果显示，保存不同时间的GEM颗粒结合PA，SDS解离后经BCA蛋白定量检测，发现保存0个月的1 U GEM颗粒结合(134.6±3.8) μg的PA，保存2个月、6个月、12个月、15个月、18个月的1 U GEM颗粒结合PA蛋白质质量分别为(138.1±5.7) μg、(135.4±6.2) μg、(138.3±3.4) μg、(129.8±6.7) μg、(132.4±4.9) μg，各个时间段之间无显著差异。说明GEM颗粒在4 ℃下至少可以保存18个月。

M：蛋白质分子量标准；1：保存0个月；2：保存2个月；3：保存6个月；4：保存12个月；5：保存15个月；6：保存18个月。图7 SDS-PAGE分析4 ℃下保存不同时间GEM颗粒的锚定活性Fig.7 SDS-PAGE assay of the GEM anchoring activity under different stored time

2.7 冷冻干燥对GEM颗粒锚定活性的影响

SDS-PAGE分析结果(图8)显示，冷冻干燥对GEM颗粒的锚定活性没有影响(冷冻干燥过程中未添加任何保护剂)。

M：蛋白质分子量标准；1：未冷冻干燥的GEM颗粒；2：冷冻干燥后的GEM颗粒。图8 冷冻干燥对GEM颗粒锚定活性影响的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE assay of the GEM anchoring activity after freeze-drying

2.8 冷冻干燥GEM颗粒的耐老化

图9显示，37 ℃保存15 d的GEM颗粒冷冻干燥样品的锚定活性与-70 ℃保存样品无明显差异。参照冷冻干燥活疫苗37 ℃10 d，可置换为4 ℃ 24个月的标准，GEM冷冻干燥样品至少可以保存24个月。

M：蛋白质分子量标准；1，4：PA表达产物；2：-70 ℃保存GEM+PA；3：-70 ℃保存GEM+PA的上清液；5：37 ℃保存15 d 的GEM+PA；6：37 ℃保存15 d 的GEM+PA上清液。图9 冷冻干燥GEM颗粒耐老化后的活性鉴定Fig.9 Identification of aging resistance of GEM particles after freeze-drying

3 讨 论

乳酸乳球菌GEM颗粒，其本质是一种细菌细胞壁肽聚糖骨架，是经过热酸处理，去除菌体内核酸及绝大部分菌体蛋白质制备成的无活性的菌体外壳。热酸处理的主要作用是去除细胞壁中的蛋白质、多糖、脂类和磷壁酸等成分[6]。磷壁酸按其在细胞表面固定的方式可以分为脂磷壁酸和壁磷壁酸2种。壁磷壁酸不深入质膜，其末端以磷酸二酯键与肽聚糖的N-乙酰胞壁酸残基连接。脂磷壁酸可跨越肽聚糖层，其末端以磷酸共价键方式连接于质膜中糖脂的寡糖基部分[7-8]。低浓度的HCl和H2SO4水解细胞壁中的多糖[9-10]，将其煮沸可以水解细胞中的脂磷壁酸[11]。脂磷壁酸可穿透厚的肽聚糖层，跨越质膜，去除磷壁酸相当于在细胞壁上开孔，在保证菌体形态的同时，可以使内容物流出，从而去除肽聚糖之外的其他杂质。

TCA可作为磷壁酸提取剂和蛋白质沉淀剂，常用于乳酸菌肽聚糖提纯。TCA制备GEM颗粒的得率及锚定活性与其他2种稀酸差异不明显，但其杂蛋白质去除效率差，可能是因为TCA作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出更多的疏水基团，使蛋白质聚集沉淀[12]。此外，随着蛋白质分子量的增大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去。有报道称，酸的类型对制备GEM颗粒的影响不大，灭活细菌溶液的pH维持在1.0才是GEM制备成功与否的关键因素[13]。本试验结果显示，在pH=1.0时，HCl与H2SO4制备的GEM颗粒质量优于TCA。

近年来，GEM抗原载运系统已成功用于多种抗原的表面展示，成为疫苗开发的新型候选系统[1-2, 14-15]。GEM颗粒结合锚钩蛋白形成的复合物，-80 ℃、4 ℃和室温保存12个月均不影响锚钩蛋白活性。无需冷链保存是GEM颗粒疫苗的一大优势[13]。本试验对GEM颗粒保存期进行研究，GEM颗粒作为一种无活性的菌体外壳，其本质就是肽聚糖骨架，表现出良好的稳定性。

本研究结果表明，0.025 mol/L的H2SO4与0.100 mol/L的HCl可制备高质量的GEM，二者效果无明显差异，该结果为制备高质量的GEM颗粒提供了试验依据。

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