地衣芽孢杆菌B-1降解西维因的环境条件

苏 赵， 胡凯弟， 朱佳雯， 王兴洁， 刘书亮,2

(1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014； 2.四川农业大学食品加工与安全研究所，四川 雅安 625014)

西维因(Carbaryl，分子式为C12H11NO2)，又名甲萘威，为一种广谱型氨基甲酸酯类农药[1]。由于其低毒高效，一经推广便迅速替代高毒低效的有机磷类农药，大量用于农业生产和室内病虫害防治[2]。但近些年研究结果表明，西维因不仅对生态环境造成影响[3]，对人体健康亦会造成多方面危害[1-2]。虽然欧盟已禁止使用，但西维因仍广泛流通于诸如美国、澳大利亚等发达国家乃至大部分发展中国家[4]。众所周知，农药并非只局限于残留在农作物上，可迁移至空气、土壤和水体[5]，甚至经食物链传播形成生物富集[6]。西维因一度成为美国地表水中最常被检测到的杀虫剂[7]，在某些食品中也有检出[8]。如何消除环境及食品中的西维因残留已成为亟需解决的问题。

目前，降解西维因及其他氨基甲酸酯类农药的方法主要有物理法[9]、化学法[10]和生物法[2]，其中生物法由于低成本、绿色、高效等优点被广泛应用。已报道能降解西维因的微生物中，细菌有假单胞菌属(Pseudomonas)[11]、节杆菌属(Arthrobacter)[12]、鞘脂菌属(Sphingobium)[13]、微球菌属(Micrococcus)[14]、根瘤菌属(Rhizobium)[15]等，真菌有曲霉属(Aspergillus)[16]、毕赤酵母属(Pichia)[17]等。随着研究的不断深入，愈来愈多的菌株将被发掘。菌株对农药的降解往往与其生长状况存在必然联系[18]，而环境因素对微生物生长和农药本身降解均有影响[19]。地衣芽孢杆菌B-1(BacilluslicheniformisB-1) 是一株可高效降解氯氰菊酯的功能性菌株[20]，也能降解西维因，因此研究其降解西维因环境条件，对菌株的实际应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

1.1.1 菌株 地衣芽孢杆菌B-1(BacilluslicheniformisB-1) ，由四川农业大学食品微生物实验室分离鉴定并保存，其培养72 h对20 mg/L氯氰菊酯的降解率为93.93%[20]。

1.1.2 培养基 Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，Tween 80 2.0 g/L，蒸馏水溶解并定容至1.0 L，pH调至7.0；固体培养基添加20.0 g/L琼脂粉。均 1×105Pa条件下灭菌15 min。

1.2 主要试剂和仪器

西维因标准品(99%)、丁硫克百威标准品(98%)、毒死蜱标准品(99%)，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司产品；叶蝉散标准品(99.8%)，中国计量科学研究院提供；1-萘酚标准品(99.5%)，美国Sigma公司产品；乙腈(色谱纯)，瑞典Oceanpak公司产品；甲醇(AR)，成都科龙试剂厂产品。

农药母液配制：准确称取适量农药，用无水乙醇溶解并定容，配制成质量浓度均为5 mg/ml的母液备用。

LC-2010C HT液相色谱仪，LC-Solution工作站，日本Shimazu公司产品；Sorvall ST 16R冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及种子液制备 挑取地衣芽孢杆菌B-1划线于LB斜面，30 ℃培养48 h，用5 ml无菌生理盐水洗下菌苔并调整细胞数量至 1×108CFU/ml，作为种子液。

1.3.2 西维因的提取与测定 取细菌均匀培养液1 ml至刻度试管中，加入等体积甲醇，超声波(40 kHz，300 W)辅助提取20 min，摇匀后用甲醇定容至10 ml，取1.5 ml离心(12 000 r/min，15 min)，吸取上清过0.45 μm有机相滤膜，弃去初滤液，取续滤液供HPLC检测。HPLC检测条件[21]：色谱柱为Sepax GP-C18柱(150.0 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈超纯水(56∶44，体积比)，流速0.5 ml/min，柱温25 ℃，进样量10 μl，紫外检测器波长220 nm。计算农药降解率和残留率，降解率=[(C0-C)/C0]×100%，残留率=1-降解率，式中，C0为样品培养液0 h时目标农药总质量浓度(mg/L)，C为样品培养液取样时目标农药残留质量浓度(mg/L)。

1.3.3 菌株B-1生长曲线和降解曲线的测定 将菌株B-1种子液按5% (体积分数)接种量分别接种于LB培养基和含100 mg/L西维因的LB培养基中，分装于250 ml锥形瓶，每瓶30 ml。30 ℃、140 r/min振荡培养72 h，同时设置添加等量无菌生理盐水的空白对照。取样时间为 0～24 h间隔2 h，24～36 h间隔4 h，36～72 h间隔12 h。生物量以细菌均匀培养液在波长600 nm处的吸光值(OD600)表示，计算西维因残留率。试验重复3次，取平均值。

1.3.4 菌株B-1降解西维因的环境条件试验

1.3.4.1 培养温度 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量接种于西维因质量浓度为100 mg/L的LB培养基中，锥形瓶分装，在不同温度下140 r/min振荡培养48 h。测定样品生物量及西维因残留率。

1.3.4.2 初始pH 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量接种于西维因质量浓度为100 mg/L、不同初始pH 的LB培养基中，锥形瓶分装，30 ℃、140 r/min振荡培养48 h。测定样品生物量及西维因残留率。

1.3.4.3 底物质量浓度 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量接种于含有不同质量浓度西维因的LB培养基中，锥形瓶分装，30 ℃、140 r/min振荡培养48 h。测定样品生物量及西维因残留率。

1.3.4.4 NaCl质量浓度 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量接种于含有100 mg/L西维因和不同质量浓度NaCl的LB培养基中，锥形瓶分装，30 ℃、140 r/min振荡培养48 h。测定样品生物量及西维因残留率。

1.3.4.5 金属离子 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量接种于含有100 mg/L西维因和0.05%(质量浓度)不同金属离子化合物(CaCl2、FeCl3、MnSO4、MgCl2、CuSO4)的LB培养基中，设置未添加上述金属离子化合物的对照，分装于锥形瓶中，30 ℃、140 r/min振荡培养48 h。测定样品生物量及西维因残留率。

1.3.5 菌株B-1降解谱试验 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量分别接种于含20 mg/L丁硫克百威、20 mg/L叶蝉散和20 mg/L毒死蜱的LB培养基中，分装于锥形瓶，30 ℃、140 r/min振荡培养一定时间后取样。采用HPLC检测各样品中农药残留量，考察菌株B-1降解不同种类农药的能力。HPLC检测条件参照文献[21]、[22]。

1.3.6 菌株B-1降解西维因中间产物的分析 将菌株B-1种子液按5%(体积分数)接种量接种于含100 mg/L西维因的LB培养基中，锥形瓶分装，30 ℃、140 r/min振荡培养。定时整瓶取样，加入等体积甲醇，超声波(40 kHz，300 W) 30 min后按照方法1.3.2处理样品。用HPLC直接检测样品中西维因变化情况，并结合添加疑似产物标准品进行分析。以添加等量无菌生理盐水为空白对照。

2 结果与分析

2.1 地衣芽孢杆菌B-1的生长曲线和降解曲线

比较菌株B-1在LB和LB-Carbaryl培养基中的生长情况(图1)。由图1可知，B-1在两种培养基中生物量略有不同，但总体趋势一致。0～8 h生长缓慢，8 h后生长迅速，28 h后进入稳定期，最终OD600分别为1.10和1.09。菌株在LB-Carbaryl培养基中的生物量较在LB培养基中的小，可能是因为西维因对菌株生长有一定的抑制作用[23]，但并不影响其对数生长期的到来。图1还显示了菌株B-1在LB培养基中对西维因的降解情况。西维因残留量在 0～8 h内变化缓慢，此时菌株生长处于延滞期；8 h后随着菌株生物量的增加，西维因开始降解，并在 20～48 h内迅速减少，可见菌株B-1对西维因降解与生长是同步的。除去空白对照组损失部分，B-1在72 h内对100 mg/L西维因的降解率达到91.21%。

图1 菌株B-1的生长曲线及对西维因的降解曲线Fig.1 Curves of growth and carbaryl degradation by strain B-1

2.2 地衣芽孢杆菌B-1降解西维因的环境条件

培养温度对西维因降解率影响较大(图2)。40 ℃以下时，随着培养温度的升高，菌株生物量增加，西维因残留量逐渐降低；40 ℃时OD600最大，为2.28，且西维因降解率也较高，为99.79%。超过40 ℃时，菌株生长减缓，未检测到西维因残留，可能是由于西维因在较高温度下不稳定而分解了[24]，但更主要的原因还是被菌株降解了。

图2 不同培养温度对菌株B-1生长及降解西维因的影响Fig.2 Effects of different culture temperatures on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

由图3可知，初始pH为6时，菌株B-1 生物量(OD600)最大，西维因残留较少，分别为1.691和40.37%。碱性环境对菌株生长有较大抑制作用，表现为菌株生物量偏低，但西维因残留较少，原因可能是西维因在碱性环境中发生水解[1]。

图3 不同初始pH对菌株B-1生长及降解西维因的影响Fig.3 Effects of different initial pH on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

菌株B-1在含不同质量浓度西维因的LB培养基中培养48 h后，菌体生长和西维因降解情况如图4所示。由图4可知，培养周期内菌株B-1对不同质量浓度的西维因有不同程度的降解，底物浓度越高，菌株生物量越低，降解率亦越低。可能是由于高质量浓度的农药对菌株有一定毒害作用，影响其生长[25]。

图4 不同底物质量浓度对菌株B-1生长及降解西维因的影响Fig.4 Effects of different substrate concentrations on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

当培养基中NaCl添加量为0时，菌株B-1生长最好，西维因降解率亦最高，为84.74%(图5)。随着NaCl添加量的增加，菌株生物量和西维因降解率均呈下降趋势。当NaCl添加量为2%时，降解率仅为65.35%。

图5 不同NaCl质量浓度对菌株B-1生长及降解西维因的影响Fig.5 Effects of different concentration of sodium chloride on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

不同金属离子对菌株B-1降解西维因的影响也不同(图6)。由图6可知，与对照相比，Ca2+、Fe3+、Mn2+和Mg2+对菌株降解西维因均有不同程度的刺激作用,其中添加Mn2+降解率最高，菌株生长最好。Cu2+对B-1生长有毒害作用[26]，菌株几乎不能生长(OD600为0.235)，西维因也未降解。

图6 不同金属离子对菌株B-1生长及降解西维因的影响Fig.6 Effects of different metal ions on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

2.3 地衣芽孢杆菌B-1的降解谱

结果(表1)显示，B-1不仅能降解丁硫克百威和叶蝉散，也具备降解毒死蜱的能力，其在LB培养基中培养168 h对20 mg/L毒死蜱的降解率为50.77%。

表1 菌株B-1的降解谱

2.4 地衣芽孢杆菌B-1降解西维因的中间产物

HPLC检测结果显示，相较于LB培养体系，LB-Carbaryl培养体系在0 h时多了1号色谱峰,随着培养时间的延长，1号色谱峰逐渐变小，随之产生的是2号色谱峰，并逐渐变大。同混合标准品HPLC色谱图比较，1号色谱峰与响应时间为7.431 min的西维因相对应，而2号色谱峰与1-萘酚(响应时间8.392 min) 对应。向LB-Carbaryl培养体系样品中添加50 μl 1-萘酚标准品溶液(200 mg/L，乙腈配制)后，2号峰面积增加。

用HPLC分析LB-Carbaryl培养体系西维因变化趋势，结果显示，0～48 h随着培养时间的延长，1号色谱峰与2号色谱峰呈此消彼长的趋势；72 h后2号色谱峰开始减小，推测菌株B-1可在LB培养基中降解1-萘酚。经进一步验证，菌株B-1在LB培养基中培养72 h对20 mg/L 1-萘酚的降解率为48.70%。

3 讨 论

环境条件的改变会影响微生物的生长及代谢状况[5]，而微生物降解农药的能力又与其生长状况密切相关[27]。45 ℃时，BacilluslicheniformisB-1生物量较40 ℃时低，但无西维因残留，推测可能是由于在菌株B-1降解的基础上，西维因在较高温度下不稳定而分解，这与Uyanik等[28]的结论相吻合。Hawker[4]在研究不同pH值下西维因降解动力学时发现，在碱性环境下其半衰期更短。因此，当pH为9时西维因残留率最低可能是生物与化学因素共同作用的结果。另一方面，当农药底物质量浓度较大或渗透压较高时，菌株生长会因胁迫压力而受抑制，降解能力必然有所下降[25]。本试验中，与不添加金属离子的对照相比，添加Ca2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+对菌株B-1降解西维因能力有不同程度的促进作用，其中Mn2+效果最为明显，而Cu2+则有抑制作用。

目前还未见关于地衣芽孢杆菌降解西维因的报道。本试验中地衣芽孢杆菌B-1可降解50～300 mg/L的西维因，于LB培养基中培养72 h对100 mg/L西维因的降解率为91.21%，降解能力强于PichiaanomalaHQ-C-01[17]和Arthrobactersp. RC100[12]。污染治理过程中，常常存在多类农药残留混合的问题，仅仅消除某一种农药是不可行的[29]。菌株B-1对20 mg/L溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的72 h降解率分别为95.62%、79.73%和55.67%[20]，对毒死蜱和其他氨基甲酸酯类农药也均有降解作用，具有广谱性，是降解农药残留的理想菌源。对菌株B-1降解西维因产物的分析结果显示，西维因降解过程中酯键断裂生成1-萘酚，而且后者能被菌株B-1进一步代谢，这与已有的报道降解途径[11-12]一致。赖文等的研究结果还表明，菌株B-1对氯氰菊酯的降解作用源于其所产生的胞外固有酯酶[20]。上述几种农药的分子中都存在酯键，其生物降解的第一步也均是酯键水解而实现解毒[30-34]，因此推测菌株B-1的降解酯酶具有广谱活性，有必要开展深入研究。

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