基于TLR4/NF-κB通路探讨滋阴潜阳方对两肾一夹高血压大鼠肾损伤保护作用的机制*

★ 濮燕屏 程斌

(安徽中医药大学研究生院 合肥 230011)

高血压的临床表现为体循环动脉压升高，头晕、头痛等，并且可引起肾脏、心脏等多种靶器官损害[1]。在高血压病发展的过程中，伴随着机体内的炎症反应[2]，而TLR4/NF-κB信号通路是这些炎症反应的共同通路[3]，其中以肾脏炎症最为主要[4]。TLR4是Toll样蛋白的一种参与炎症反应的同源物，可激活TLR4/NF-κB信号通路，引起其下游效应因子NF-κB的表达[5]。有研究指出，当机体内产生免疫炎症反应时，TLR4和NF-κB被激活表达，诱导肾组织细胞成纤维化，促进炎症因子的释放，如白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等，加重肾损伤[6]。本研究通过探寻在两肾一夹(2K1C)高血压大鼠中滋阴潜阳方对TLR4/NF-κB信号通路的影响，分析滋阴潜阳方对高血压肾损伤保护作用的可能机制，证明其对高血压肾损伤的影响，为临床应用提供可靠的数据参考。

1 材料

1.1 动物 40只雄性清洁级同源同系SD大鼠，安徽中医药大学实验动物中心，(160±20)g，8周龄，合格编号SCXK(皖)2011-002，正常饲养，自由饮水。

1.2 药物 滋阴潜阳方煎剂：生地黄、熟地黄各15g，钩藤、何首乌各20g，牡蛎、石决明各30g。购自安徽省中医院，汤液浓缩至2g/mL。

盐酸贝那普利(成都地奥制药集团有限公司，国药准字H20053390，10mg/片)，购自安徽省中医院，药片研末，以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成1mg/mL，灌胃时将药液稀释为0.1mg/mL。

1.3 试剂与设备 Trizol(Invitrogen公司，批号：90802)；DEPC、SDS(Sigma公司，批号：20140802554、CAS：151-21-3)；Quanti Fast SyBr Green PCR kit(Qiagen，批号：151025434)；逆转录试剂盒(Revert Aid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)；PVDF膜、预染蛋白Marker(Thermo公司，批号：00221108、K5CA1685L)；Tris碱(Solarbio公司，批号：1128Q0722)；TLR4 (Bioss公司，货号：bs-1021R，分子量90kDa)；NF-κBp65(abcam公司，货号：ab16502，分子量64kDa)等。

无创血压测量仪(上海奥尔科特生物科技有限公司)；电泳仪(Tanon，EPS 300型)；JW3021HR离心机(安徽嘉文仪器制造有限公司)；光学显微镜(日本Nikon 80i)；PCR仪(Thermo，PIKOREAL 96)；0.25mm U型银夹，常规手术器械等。

2 方法

2.1 造模方法 大鼠进行断食不断水饲养12h，手术按照0.35mL/100g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，背部向上，固定大鼠，于浮肋处(大约为背部第3腰椎棘突水平)，从后背正中右侧1cm处开放约1.5cm的手术切口[7]。开口后找到右肾组织，剥离右肾动脉，利用0.25mmU型银夹狭窄大鼠右肾动脉，左侧不触及。假手术组的手术过程同模型组，但不给予银夹狭窄右肾动脉。创口消毒处理并去除血迹，术后注射庆大霉素2万U/支，连续注射3～5天，常规饲养。2周后，评估造模情况，测量大鼠血压较术前升高22.6mmHg(3kPa)，且高于135mmHg(18kPa)者为造模成功[8]。

2.2 分组方法 随机(随机数字表法)抽取8只大鼠为假手术组，剩余32只建造2K1C高血压大鼠模型，造模后死亡4只，模型复制成功24只，将成功复制模型的大鼠进行编号，随机(随机数字表法)分为模型组、贝那普利组和滋阴潜阳组。

2.3 给药方法 各组在造模2周后开始灌胃，两治疗组分别给予2g/mL滋阴潜阳方水煎剂(1mL/100g)、0.1mg/mL贝那普利混悬液(1mL/100g)灌胃，非治疗组给予等体积生理盐水灌胃，灌胃时间为每天上午9点，连续8周。

2.4 取材方法 大鼠灌胃8周后，禁食不禁水12h，测体重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开大鼠腹腔，取左侧肾脏，用生理盐水冲洗，并用滤纸拭干，去除包膜，对半纵向分开肾脏，一半放入4%多聚甲醛溶液中固定待测。左肾另一半放入冷凝管中，置于液氮中，放于-80℃冰箱待测。

2.5 指标检测

2.5.1 血压测定 将鼠尾套入血压仪尾套测尾动脉血压(术后2周、用药4 周及8 周)。安静状态下操作，反复3次，取均值。

2.5.2 实时PCR技术测定TLR4-mRNA含量 使用全自动紫外分光光度计对TLR4-mRNA的浓度、纯度进行定量分析。按要求加样后进行RT-PCR反应，扩增产物电泳结果经扫描后进行图像分析，以TLR4与β-actin的比值反映TLR4的mRNA表达水平。

2.5.3 WesternBlot法测定TLR4、NF-κBp65核蛋白表达 将制备好的蛋白样品以及Marker加入SDS-PAGE凝胶孔内，进行电泳，至目标蛋白对应大小的Marker条带在分离胶被分离为止。将所需凝胶经过转膜、封闭、孵育、曝光后，运用ImageJ软件分析结果，以Actin、GAPDH为内参进行目的蛋白表达水平差异的比较。

2.5.4 炎症因子测定 灌胃8周(造模10周)后，断食不断水12h，麻醉后手术取左侧肾脏，生理盐水冲洗，并用滤纸拭干，选部分肾脏，取组织匀浆上清，ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-8的含量。

2.5.5 肾脏组织病理形态学分析 取部分去除包膜的大鼠左侧肾脏，放入固定液中固定，石蜡切片(3μm)，镜下观察HE染色的肾组织变化。

3 结果

3.1 大鼠尾动脉压的变化情况 见表1。手术2周后，模型组、贝那普利组、滋阴潜阳组血压较假手术组相比均有所升高(P<0.05)，提示高血压造模成功。灌胃4、8周后，滋阴潜阳组、贝那普利组血压较模型组相比均有所下降(P<0.05)。

表1 各组大鼠血压的比较 mmHg

注：造模2周，与假手术组相比，*P<0.05；灌胃4周、8周，与模型组相比，#&P<0.05。

3.2 大鼠肾脏组织TLR4-mRNA的含量表达 结果见表2。与假手术组相比，模型组大鼠TLR4-mRNA表达明显增强(P<0.01)；与模型组大鼠相比，滋阴潜阳组、贝那普利组大鼠TLR4-mRNA表达明显减少(P<0.01)。

表2 各组大鼠肾脏组织TLR4-mRNA的含量表达

注：与假手术组比，**P<0.01；与模型组比，##P<0.01。

3.3 大鼠肾脏组织TLR4、NF-κBp65的含量表达 结果见表3。与假手术组相比，模型组TLR4、NF-κBp65两个指标蛋白表达均明显升高(P<0.01)；灌胃8周后，与模型组相比，滋阴潜阳组、贝那普利组蛋白具有显著性差异(P<0.01)。

表3 各组大鼠肾脏组织TLR4、NF-κBp65的含量表达

注：与假手术组比，**p<0.01,与模型组比，##P<0.01.

3.4 滋阴潜阳方在肾脏组织上清IL-6、IL-8、 TNF-α的表达影响 见表4。模型组上清中IL-6、IL-8、TNF-α水平均较假手术组相比显著升高(P<0.05)；贝那普利组、滋阴潜阳组IL-6、IL-8、TNF-α水平较模型组新相比显著降低(P<0.05)。

表4 各组大鼠肾脏组织上清中炎症因子的比较 ng/L

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与贝那普利组比较，△P>0.05。

3.5 肾脏组织病理形态学 结果见图1。HE染色示：假手术组的大鼠肾组织中血管内皮细胞、基底膜、系膜细胞等镜下结构未见明显改变；模型组较假手术组肾组织系膜区扩张，基底膜增厚、系膜细胞肥大；两治疗组较模型组相比，肾组织基底膜变薄，血管内皮细胞、肥大的系膜细胞减小。

4 讨论

中医学中没有高血压肾损伤的专属病名，其相关论述可见于“肾劳”“腰痛”等疾病范围。课题组在其病因病机为肝肾阴虚的理论基础之上，总结滋阴潜阳方，方中的生地黄、熟地黄、何首乌滋肝肾、养阴精，钩藤、石决明、牡蛎熄风潜阳以降压。全方标本兼治、和调阴阳，从而达到平稳降压的目的[9]。廖圣宝等[10]研究指出在中医证候属性中2K1C大鼠模型属于阴虚阳亢型。本研究应用此模型，观察滋阴潜阳方对该模型大鼠的干预是符合中医辨证论治的思维。

A.假手术组；B.模型组；C.贝那普利组；D.滋阴潜阳组

NF-κB是广泛存在于真核细胞中的一个重要的转录因子，新近研究发现，NF-κB亦存在于肾脏组织细胞中，参与高血压肾损害的过程[11]。NF-κB能与核内DNA特定的序列即κB结合位点结合，增强各种炎症因子的表达，由此引发大量的炎性细胞积聚浸润于炎症部位，导致持续或放大的炎症反应[12]。高血压在发生过程中会出现多脏器的低度炎症，损伤靶器官的炎症组织会释放多种炎症因子，炎症因子作用于NF-κB，形成相互影响的炎症循环过程，加重高血压病的病情[13-14]。

本次实验研究表明，①造模后2周，大鼠尾动脉收缩压开始稳定上升，且与假手术组相比，其余三组大鼠血压均明显升高，以此提示2K1C模型复制成功。灌胃4、8 周后，与模型组相比，两治疗组大鼠的血压均明显下降，证明中药复方(滋阴潜阳方)具有一定的降压效果。②滋阴潜阳方能够一定程度上抑制2K1C高血压大鼠肾脏细胞中TLR4-mRNA的表达。与假手术组相比，模型组TLR4-mRNA表达增强(P<0.01)；经过治疗后，与模型组相比，滋阴潜阳组与贝那普利组TLR4-mRNA表达降低(P<0.01)。滋阴潜阳方可以通过降低TLR4-mRNA抑制炎症反应。③滋阴潜阳方能够一定程度上抑制2K1C高血压大鼠肾脏组织中TLR4、NF-κB的表达。与假手术组相比，模型组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达明显增强(P<0.01)；经过治疗后，与模型组相比，滋阴潜阳组与贝那普利组TLR4、NF-κB的表达明显降低，具有统计学意义(P<0.01)。滋阴潜阳方可以通过抑制降低TLR4、NF-κB的蛋白表达抑制炎症反应。④模型组IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平均高于假手术组；两治疗组IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平与模型组相比均有所下降。这说明在大鼠血压升高的同时，肾损伤也在发生；用药后，两治疗组的炎症水平都得到一定程度的控制，证实了滋阴潜阳方对降低炎症因子含量具有一定的干预作用。⑤肾组织切片提示假手术组的镜下观未见特殊改变；与假手术组相比，其余三组的镜下结构均出现了一定的病理变化；但两治疗组的病理改变较模型组相比减轻了很多。这说明，滋阴潜阳方可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活来降低炎症因子的释放，从而改善高血压对肾脏的损伤，证实其对肾损伤具有一定的干预保护作用。

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