不同传统香型及产地的上部复烤烟叶中多酚类成分含量比较分析

谢媛媛，冯燕燕，苏加坤，罗娟敏，王义明，郭磊，蔡继宝，罗国安

1 清华大学化学系，北京 100084；

2 江西中烟工业有 限责任公司，江西南昌 330096；

3 珠海清大弘瑞生物科技有限公司，广东珠海 519085

烟草是重要的经济作物，人类在吸烟过程中享受卷烟燃吸带来的令人愉悦的香味，以满足心理、生理需求，故烟草香味是评价烟叶品质的重要影响因素，而烟叶的品质最终由化学成分决定[1]。

我国烟草种植区域辽阔，生态环境复杂多样，不同生态区烟叶的香气风格存在较大差异。长期以来，我国烤烟香型可分为清香型、中间香型和浓香型3类[2]。烟叶对生态环境十分敏感，产区的生态条件决定和影响着烟叶的品质和香型风格，因此我国烤烟香型风格分布也显示了明显的地域特征。传统清香型烤烟香气清雅飘逸，烟味较淡，杂气较轻，主要分布于云南、四川、福建等省；传统浓香型烤烟香气浓馥沉溢，烟味浓厚，吃味干净，分布于广东、江西、湖南、河南、安徽、山东等地区；传统中间香型烟叶介于清香型与浓香型之间，兼有两者的香味特征，以湖南、山东、黑龙江、贵州、陕西、湖北、重庆等地区为代表[3]。

然而随着烟叶生产、卷烟加工等技术水平的提升，3大香型的划分早已无法充分彰显各产区烟叶的特色，特别是“非浓非清即为中”的简单界定方法，导致中间香型内涵不清、特征不明。长期以来，我国主要依靠专业人员通过感官评吸来确立烟叶香型风格，受人为主观因素影响较大，缺乏统一的客观标准[4]。烟草中的化学成分是决定烤烟外观质量、内在质量、物理特性、烟气特性及香型风格的主要内在因素，因此，使用现代分析技术，探讨建立评价烤烟香气或香型风格的量化指标成为烟草科技工作者研究的热点问题之一[5-9]。2011年启动的中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项从生态、感官、化学、代谢4个维度对全国烤烟烟叶香型风格进行评价、分析与交叉验证，将全国烤烟烟叶产区划分为8大生态区，相应的把烟叶风格划分为8种香型，突破了传统浓、中、清3大香型的传统划分[10]。

多酚是烟草重要的次生代谢产物和香气物质前体，以葡萄糖苷和酯的形式存在，对烟草的生长发育、调制特性、烟叶色泽以及烟气香味和生理强度等方面均起重要作用，是衡量烟草品质的一个重要因素[11-14]。烟草中多酚类物质主要有咖啡单宁类（绿原酸）、香豆素类（莨菪亭，莨菪灵）和黄酮醇类（芸香苷，山柰酚糖苷）等，其中绿原酸和芸香苷（即芦丁）是烟叶中主要的多酚类物质，占烟叶中多酚类物质的90%以上[15-16]。部分烟草多酚化合物的含量还可能与烟草的品质呈正相关关系[17-20]。

本研究采用HPLC-Trap/MSn和HPLC-TOF/MS联用技术鉴别解析烟叶中5种主要多酚类化合物，采用HPLC-UV法建立了5种烟叶多酚类化合物含量测定分析方法，测定了来源于不同产区、3种主要传统香型烟叶样本中多酚类化合物的含量。从传统香型划分（清香型、中间香型和浓香型）、《中国烟草种植区划》将中国划分为5大烟叶产区（西南产区、东南产区、长江中上游产区、黄淮产区和东北产区）以及2017年6月发布的《全国烤烟烟叶香型风格区划》将全国烤烟烟叶产区划分为8大生态区3个角度比较了4种多酚类成分的分布情况，比较它们在不同产地、不同香型烟叶中的分布规律，为从化学成分维度对全国烤烟烟叶香型风格进行评价、分析提供基础研究数据，以明晰不同香型区域定位以及化学特征。

1 材料与方法

1.1 供试材料

收集了2011年来源于不同产区、不同香型的烟叶样品133个：其中浓香型烟叶43个，产于广东、江西、湖南、河南、安徽、山东6个省份；中间香型烟叶41个，产于湖南、山东、黑龙江、贵州、山西、湖北、重庆7个省份；清香型烟叶49个，分别产于云南、福建、四川和贵州4个省份，所有烟叶样本均为上部叶，经上海烟草集团有限责任公司技术中心收集，并统一复烤后制成烟丝，40℃下烘干，用植物粉碎机粉碎，过60目筛，用塑料罐密封，置于低温冰箱（-20℃）中保存，为避免烟叶中潜香物质因储藏不当而发生化学成分的变化，并在收样当年即进行样品测定。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：岛津高效液相色谱仪SIL-20A（包括低压二元梯度泵，二极管阵列检测器(DAD)，柱温箱，Chemistation化学工作站，日本SHIMADZU）；Agilent 1100 series LC/MSD液质联用系统（包括Agilent SL型多级离子阱质谱仪、低压二元梯度泵、二极管阵列检测器（DAD）、柱温箱、Chemistation化学工作站）；Agilent 1200 series MSD/TOF-MS质谱仪（包括Agilent SL型多级TOF质谱仪、低压二元梯度泵、二极管阵列检测器（DAD）、柱温箱、Chemistation化学工作站）； Milli-Q Synthesis 超纯水纯化系统；Mikro 22R离心机（德国Hettich公司）；XP205型电子天平（十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO )。

试剂：甲醇（分析纯），乙睛（J.T.Baker，色谱纯），88%甲酸（北京第二化工厂，分析纯），乙酸（J.T.Baker，色谱纯），MilliQ-超纯水。绿原酸和芦丁购于四川维克奇生物科技有限公司，纯度大于98%。

1.3 供试品溶液制备

取0.3 g烟叶粉末，精密称定，加入5 mL 50%甲醇水提取溶剂，涡旋提取2 min， 5000 rpm离心5 min，取上清液，残渣再次加入5 mL 50%甲醇水提取溶剂，涡旋提取2 min， 5000 rpm离心5 min，取上清液，合并两次上清液，定容至10 mL。

1.4 对照品溶液制备

取绿原酸和芦丁标准品各25 mg，加入甲醇溶解并定容，摇匀，得到混合对照品储备溶液，放入4℃冰箱备用。取各储备液适量，用50%甲醇水溶液配置系列混合对照品溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A-0.3%甲酸水，B-乙腈；梯度洗脱：0 ～10 min（11%～13%），10～20 min（13%～28%），20～30 min（28%～75%），30～35 min（75%～95%），35～40min（95%～11%）；柱温：30℃；流速：1.0 min/mL；进样量：10 μL；检测波长：325 nm、354 nm。

1.6 质谱条件

Ion trap-MSn：采用正负离子扫描（±），分流比为2：1；自动记录2级总离子流（TIC）图，扫描质量范围50～1000 amu，干燥气流速7 L/min，干燥气温度350℃，雾化气压25 psi。质谱检测设置时间程序，前40 min采集。

TOF-MS：负离子全扫描，分流比设为2：1；自动记录三级总离子流图（TIC），扫描质量范围50～1500 amu；干燥气温度350℃；干燥气流速7 L/min；雾化气压30 psig；毛细管电压3500 V；碎裂电压175 V；Skimmer：60 V；八级杆射频电压250 V。

1.7 系统适用性试验

1.7.1 线性关系考察

取一定量绿原酸和芦丁标准对照品，精密称定，并稀释成不同浓度的混合对照品溶液，以浓度为横坐标，各浓度点对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。新绿原酸和隐绿原酸为绿原酸的同分异构体，它们具有相同的紫外吸收，故本研究中新绿原酸和隐绿原酸的含量采用绿原酸的标准曲线进行计算。

1.7.2 定量限、检测限的测定

采用信噪比法检测绿原酸、芦丁的检测线及定量限。以信噪比为3:1时相应浓度确定检测限，以信噪比为10:1时相应浓度确定定量限。

1.7.3 精密度试验

取2011年批号为180的烟草粉末样品，制备供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次。计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.7.4 稳定性试验

取2011年批号为180的烟草粉末样品，制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样。计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.7.5 重复性试验

取2011年批号为180的烟草粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进样分析。计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.7.6 加样回收率试验

取2011年批号为180的烟草粉末样品0.15g，6份，精密称定，每份分别加入与样品中各成分含量相近的混合对照品溶液，按1.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并根据测定量、加入量和原含量计算回收率。

1.7.7 样品测定

取133批来源于不同产区、不同香型的烟叶，采用“1.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，采用“1.5”项下色谱条件进行测定，采用外标法计算不同产区、不同香型的烟叶中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和芦丁的含量。

2 结果与分析

2.1 烟叶质谱定性结果

利用高效液相色谱-离子肼多级质谱碎片分析和飞行时间质谱分析烟叶样本，结果表明（图1）5个主要多酚类化合物分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷。质谱分析结果如表1所示。

图1 烟草HPLC指纹图谱（检测波长：325nm）Fig. 1 HPLC/DAD Fingerprint of Tobacco（Wavelength：325nm）

表1 烟草香味成分HPLC-Trap/MSn解析及HPLC-TOF/MS相对分子质量匹配Tab.1 LC-Trap/MSn analysis of tobacco and TOF/MS matching results of relative molecular mass

续表1

2.2 系统适用性试验

2.2.1 线性关系考察及定量限和检测限

各指标成分的回归方程、线性范围、相关系数见表2。4种指标成分得到较好的分离，在线性范围内线性关系良好。绿原酸和芦丁的检测限分别为0.14、0.14 μg，定量限分别为：0.30、0.30 μg。

表2 线性回归方程Tab. 2 Result of standard curve method

2.2.2 精密度试验

在上述色谱条件下，连续进样6次进行精密度试验。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷的保留时间RSD分别为0.884%、0.494%、0.514%、0.014%、0.015%，峰面积RSD分别 为 1.305%、0.575%、0.152%、0.251%、2.49%。各指标成分的保留时间RSD在0.01%～0.8%之间，峰面积RSD处于0.15%～3.8%之间，表明方法所采用的HPLC仪器及整体系统精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

取供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析考察供试品溶液的稳定性。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷的保留时间RSD分别0.130%、0.108%、0.106%、0.022%、0.027%， 峰 面 积RSD分 别0.367%、2.014%、0.226%、0.361%、3.668%。各指标成分的保留时间RSD在0.02%～0.13%之间，峰面积RSD处于0.2%～3.7%之间，表明经制备的样品在常温实验条件下稳定性较好，24 h内能保证实验结果的科学可靠。

2.2.4 重复性试验

取2011年批号为180的烟草粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进样分析。测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷保留时间RSD分别为0.106%、0.120%、0.124%、0.024%、0.024%，峰面积RSD分别为0.931%、1.963%、0.987%、2.423%、1.645%。各指标成分的保留时间RSD在0.02% ～ 0.12%之间，峰面积处于0.9% ～2.4%之间，表明该方法的重复性较好。

2.2.5 加样回收率试验

加样回收率结果如表3所示，绿原酸和芦丁的加样回收率分别是97.92%和101.63%之间，说明方法准确度良好。

2.3 不同香型烤烟多酚类成分含量测定结果

133批不同产区、不同传统香型的上部烤烟叶中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和芦丁的含量测定结果如表4所示。

表3 加样回收率结果Tab. 3 Result of recovery test

表4 不同产区、不同香型的烟叶中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和芦丁的含量Tab.4 Contents of 4 polyphenols determined in tobacco samples of different flavor mg/g

续表4

续表4

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续表4

续表4

不同传统香型烟叶中4种多酚类成分含量的比较结果如图2所示。结果表明，清香型烟叶中4种多酚类成分总含量（26.19±4.07 mg/g）＞中间香型（25.43±3.09 mg/g）＞浓香型（22.23±3.75 mg/g）。新绿原酸在清香型烟叶中含量（2.39±0.46 mg/g）＞中间香型（2.25±0.40 mg/g）＞浓香型（1.84±0.39 mg/g）；芦丁在清香型烟叶中含量（8.74±1.41 mg/g）＞中间香型（8.25±1.52 mg/g）＞浓香型（5.99±1.40 mg/g）。新绿原酸和芦丁含量在不同香型的烟叶样本中具有显著性差异，而绿原酸和隐绿原酸在不同香型烟叶中平均含量差异不具有统计学意义。以上研究结果提示新绿原酸和芦丁的含量与香型关系更为密切。而同一香型样品中4种主要多酚类成分含量差异较大，推测与同一香型烟叶样品基因型不同，来源产地不同，土壤和气候条件等因素可影响烟叶中多酚类成分含量有关[19-20]。

图2 4种多酚类成分在不同香型烟叶药材中含量比较Fig. 2 Comparsion of 4 polyphenols determined in tobacco samples of different flavor

参考《中国烟草种植区划》，将中国划分为5大烟叶产区，其中西南产区包括云南、贵州和四川；东南产区包括湖南郴州和永州、广东韶关、福建、安徽和江西；长江中上游产区包括湖北、重庆、湖南张家界和陕西；黄淮产区包括河南和山东；东北产区包括黑龙江。本研究比较了4种多酚类成分在不同烟叶产区的分布规律，结果如图3所示。其中长江中上游产区的烟叶总多酚含量最高（25.73±3.55 mg/g），西南产区烟叶次之（25.73±3.01 mg/g），黄淮产区烟叶中总多酚含量最低（22.44±4.81 mg/g）。新绿原酸、隐绿原酸和芦丁的含量在不同烟叶产区的烟叶样本中差异较为显著，相对标准偏差分别为20.25%，14.31%和17.13%，而绿原酸含量在11.74±2.01 mg/g（西南产区）～13.09±2.22 mg/g（东北产区）之间，在5个产区之间的含量变化相对标准偏差为4.28%，并不显著。

中国烟草总公司于2017年6月发布了《全国烤烟烟叶香型风格区划》[10]，从生态、感官、化学、代谢4个维度对全国烤烟烟叶香型风格进行评价、分析与交叉验证，将全国烤烟烟叶产区划分为8大生态区，包括西南高原生态区-清甜香型，黔桂山地生态区-蜜甜香型，武陵秦巴生态区-醇甜香型，黄淮平原生态区-焦甜焦香型，南岭丘陵生态区-焦甜醇甜香型，武夷丘陵生态区-清甜蜜甜香型，沂蒙丘陵生态区-蜜甜焦香型，东北平原生态区-木香蜜甜香型。图4所示为4种多酚类成分按照《全国烤烟烟叶香型风格区划》不同香型风格区划烟叶样品中的分布情况进行统计分析。绿原酸是烟叶中含量最高的多酚类成分，其在不同香型风格区划的烟叶中含量在11.67±1.34～15.07±4.49 mg/g之间，含量变化差异不大（相对标准偏差RSD为8.67%）。其中武夷丘陵生态区-清甜蜜甜香型烟叶中总多酚含量最高（27.72±6.22 mg/g），沂蒙丘陵生态区-蜜甜焦香型烟叶中总多酚含量最低（21.20±4.93 mg/g）。其中，绿原酸（15.07±4.49 mg/g）、新绿原酸（2.82±0.55 mg/g）和隐绿原酸（3.00±0.71 mg/g）等3个咖啡酰基奎宁酸类成分的含量在武夷丘陵生态区-清甜蜜甜香型烟叶中最高，黄酮类化合物芦丁（9.23±1.08 mg/g）在西南高原生态区-清甜香型烟叶中含量最高。

图3 不同产区烟叶样本中4种多酚类成分含量比较Fig.3 Comparsion of 4 polyphenols determined in tobacco samples of different product region

图4 4种多酚类成分在不同香型风格区划烟叶药材中含量比较Fig.4 Comparsion of 4 polyphenols determined in tobacco samples of different flavor and regionalization

3 讨论

烟叶成熟期气温和成熟期日照时数是影响烟叶清香型风格形成的关键气象因子[21]。清香型烟叶主要产于西南产区的云南和四川，以及东南产区的福建省。云南和四川清香型烟叶产区移栽期气温较高，成熟期气温较低，全生育期气温变化幅度较小；在烟叶移栽期至团棵期的日照时数较高，累计达400 h以上；降雨量集中在旺长至成熟前期；而福建清香型产区在温光水的匹配协调上具有气候独特性：烟叶全生育期热量偏低，日照时数偏低，气温直线上升，降雨集中在成熟中期。而从不同烟叶光合同化能力比较来看，清香型烟叶具有“高光合、低呼吸、高积累”的碳代谢特征[22-25]。四川和云南产的清香型烟叶中光合作用主要代谢物黄酮苷类成分（芦丁）的含量显著高于福建产烟叶，与西南产区光照时间较长，光照强度大等密切相关；福建产清香型烟叶中绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸等咖啡酰基奎宁酸类成分的含量则显著高于西南产区。湖南郴州和永州是浓香型烟叶的主要产地（东南产区），而湖南张家界属长江中上游中间香型烟叶的主要产地；湖南郴州和永州与张家界产烟叶样本中多酚类成分含量显著不同。其中郴州和永州产的浓香型烟叶中绿原酸（2.26±0.29 mg/g）、新绿原酸（12.69±1.57 mg/g）和隐绿原酸（2.70±0.49 mg/g）等咖啡酰基奎宁酸类成分的含量则显著低于张家界的中间香型烟叶（绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸的含量分别为2.72±0.27 mg/g，14.08±0.54 mg/g和3.26±0.35 mg/g）；而郴州产浓香型烟叶芦丁含量（7.38±0.89 mg/g）则略高于张家界的中间香型烟叶（6.91±0.71 mg/g）。贵州是中间香型烟叶的典型产区，其气候条件、光照时间、海拔高度和降雨水平等与云南（清香型烟叶主产区）较为相近。比较贵州和云南两地的烟叶中多酚类成分含量，结果表明，云南产清香型烟叶中四种酚酸类成分含量（新绿原酸2.29±0.42 mg/g，绿原酸 11.93±2.49 mg/g，隐绿原酸 2.52±0.47 mg/g，芦丁 9.00±1.14 mg/g）与贵州产中间香型烟叶（新绿原酸2.17±0.15 mg/g，绿原酸11.82±1.17 mg/g，隐绿原酸2.60±0.24 mg/g，芦丁8.28±1.18 mg/g）无显著性差异。以上结果提示，烟叶种植地的生态环境（产地）对烟叶中多酚类成分含量影响较大，而多酚类成分在烟叶香型的判别中并非决定要素。

4 结论

新绿原酸和芦丁的含量与烟叶传统香型（清香型、中间香型和浓香型）密切相关；烟叶种植地的生态环境（产地）对烟叶中多酚类成分含量影响较大，而多酚类成分在烟叶香型的判别中并非决定要素。多酚类成分在《全国烤烟烟叶香型风格区划》划分的8大生态区之间的差异更为显著，提示这种产区划分方式比传统的3大香型和五大产区的划分方式更为合理。多酚类化合物仅是烟叶复杂化学物质体系中的一种，判别烟叶香型的标志成分及含量范围仍需结合其他化学物质及烟区的 气候因子、降雨、光照时间、海 拔高度、土壤条件等多方面因素进行关联分析。

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