基于专利角度的纤维素降解生物法预处理研发进展

郑玉荣， 靳军宝,2， 白光祖， 吴新年*， 刘秋艳,2

（1. 中国科学院兰州文献情报中心，甘肃 兰州 730000；2. 中国科学院大学，北京 100049）

纤维素降解研发及产业化是全球热点方向之一，全球范围内天然纤维素原料非常丰富（包括农作物秸秆、林业副产品、城市垃圾等），将纤维素进行转化生产生物燃料、饲料、食品等生物质产品对于解决环境污染、资源浪费、食品短缺、能源危机等方面具有现实意义[1-2]。全球纤维素利用主要通过糖平台（生物法）和热化学平台转化[3-4]，糖平台先将纤维素原料转化为可发酵型糖，再利用酵母发酵转化为生物产品，热化学平台则先气化纤维素原料再转化为生物产品。

图1 天然纤维素利用流程

纤维素的生物转化利用分为原料预处理、酶水解、糖发酵3个阶段（如图1所示），目前主要的技术瓶颈在于预处理技术不够成熟、纤维素酶活性较低及转化效率不高等，造成生产成本过高[5]。预处理阶段应用较多的是物理化学法（包括蒸汽爆破、氨纤维爆破等）、化学法（酸处理、碱处理、离子液体处理等）、物理法等[6]，在效率相对较高的同时带来新的环境污染与能源消耗问题，后续处理也存在其他方面的问题（如抑制问题）。生物法克服了其他方法的缺点，但存在效率有待提高和成本过高的问题（时间成本和经济成本），但是从长远看，通过生物技术和生物工程解决效率和成本问题[7-8]，生物法将得到快速发展[9-10]。

全球围绕生物法的效率问题和成本问题进行了大量的基础研究，经由相关研究机构和企业合作，建设纤维素产业化利用示范装置，推进纤维素的生物转化进程。我国《可再生能源发展十三五规划》新增投资2.5万亿元发展包括生物质利用在内的可再生能源，美国和欧盟也以立法形式规定了将来某时间段纤维素燃料在整个燃料体系中的比例，并且以政策形式进行支持。

本文收集了国内外纤维素降解生物法预处理方面的发明专利（数据来源：Derwent Innovations Index），应用Thomson Data Analyzer、INNOGRAPHY等主流情报分析软件，对全球范围内纤维素降解生物法预处理总体研发情况、技术研发脉络、重点技术方向及核心技术发展态势进行了分析。

1 专利总体研发进展

1.1 总体研发态势

截止2017年底（检索日为2017年12月31日），全球纤维素降解生物法预处理专利数为572条，占到整个预处理技术的6.93%（总预处理专利技术8256条），总体上不占优势，处于发展期（图1），其中2015年达到74条，为历年最高（注：因专利数据滞后，2016、2017年的专利数据不全）。

图2 纤维素降解生物法预处理专利技术年际变化

图3 纤维素降解生物法预处理专利技术主要研发国家

如图2所示，美国是纤维素降解生物法预处理专利主要的研发国，另外中国、欧洲、日本也是重要的研发地区。如表 1，诺维信是纤维素降解生物法预处理专利技术最主要的专利权人（109条，占整个生物法预处理技术的19.06%，下同），其他还包括荷兰帝斯曼（38条，占6.64%）、加拿大IOGEN（29条，占5.07%）、杜邦丹尼斯克、法国石油与新能源研究院等（如表1所示）。

表1 纤维素降解生物法预处理主要研发机构

（续表1）

1.2 主要研发方向

纤维素降解生物法预处理专利技术主要涉及发酵技术与工艺（包括产品，占78.40%）、酶工程技术（占43.39%）、菌种选育技术（占38.91%）三个技术方向，其中能产生高效降解酶的菌种选育技术是生物法预处理的关键。

如表2，经分析相关专利技术研发脉络，上世纪80年代开始，纤维素降解生物法预处理专利技术经历了酶的分离与培养、微观层面研发（包括纤维素细胞壁结构、DNA序列等）、破除木质素结合键、减少酶用量及提高发酵率、同步糖化发酵、产业化的经济性及可行性、基因改造与表达、多阶段联合处理、耐高温多功能降解菌种等（如表2所示）。

表2 纤维素降解生物法预处理技术演进

诱变选育技术的主要研发机构包括诺维信、加拿大IOGEN、杜邦丹尼斯克等，技术重点是选育的菌株分泌高效组合酶对木质素进行降解，组合酶的重要特征一是表现出显著协同作用，二可以全流程作用起作用，减少后期糖化和发酵阶段的外源酶加入量。具体技术点包括极端环境菌种（宽pH范围、高热、低温等）筛选技术、菌株高通量筛选技术（包括微流控真菌高通量筛选技术、流式细胞仪细菌高通量筛选技术等）、五碳糖六碳糖共利用菌株选育技术、高效物理化学组合诱变技术、高效菌定向选育技术、应用于固态发酵菌种选育技术、高效物理（紫外、重离子、等离子辐射等）诱变技术、高耐热工程菌模拟预测技术、流程化选育平台、多菌协同培育技术等。

基因工程选育技术是通过遗传工程对降解木质素（半纤维素）起作用的基因片段进行基因改造，从而提高降解效率。研发主要集中在两个方向上，一是对新基因（核酸序列）的筛选、鉴定、分离，二是通过遗传工程改造基因并进行菌株表达。具体的技术点包括蛋白组学技术、多基因融合技术、菌种突变技术、定向进化集成技术、基因定向突变技术、高效降解菌基因（组）鉴定技术、同源重组增强技术、不需预处理生物降解菌改造技术、活性位点识别技术、高效纤维素菌株基因组（群）融合技术等。

近年来，国内针对纤维素降解生物法预处理在酶种选培育、基因工程改造、成本控制等方面开展了大量的研究，中国石化通过选育木霉属菌株去除预处理阶段引入的多种抑制物[11]、华中科技大学张晓昱团队通过担子菌对木质纤维素原料进行预处理、降解与转化[12]，山东尤特尔采用中性纤维素酶预处理木质纤维素以降低成本[13]，另外青岛蔚蓝、南京百斯杰、宁夏夏盛、华东师范大学等也有针对性的开展了相关研发活动。

1.3 后续研发重点

引用专利数据集的文献，称为该专利数据集的后引文献，通过后引文献可以分析该数据集专利技术对后续专利技术研发、应用等方面的作用与影响，尤其核心专利技术对后续研发的影响具有重要作用，很多后续研发的专利技术会围绕核心专利进行专利布局，其结果会影响产业布局和经济利益。

分析相关后续研发机构分布，除了诺维信、杜邦丹尼斯克、荷兰帝斯曼、加拿大IOGEN、私有酶技术公司等研发主力外，英国石油公司、壳牌石油公司、美国可再生能源国家实验室、阿本戈生物能源等一些石油和能源公司也对相关技术进行大量引用。

分析后引专利的技术方向可以发现，后引主要以应用为主，涉及到制备目标产品、所使用的酶、所使用的材料、发酵的工艺等，其中在堆制有机肥料、肥料与土壤调理剂的混合物、有机废料回收或加工、动物饲料、添加酶或微生物进行谷物材料发酵等技术是以后热点的研发方向，一定程度上说明降解研发方向和降解产品趋向多元化。

1.4 研发基础分析

科学技术能持续不断的向前推进，是因为建立在之前的基础研究之上。专利数据集所参考的文献，称为该专利数据集的前引文献，是专利技术继续研发的基础。研究前引文献可以分析该数据集专利技术所赖以产生的基础科学研究发展态势，通过研究主题的重点、发展与变化、对核心技术发展脉络等进行分析，可以遴选出具有发展前景的核心技术方向及其演化路径。

如表3所示，纤维素生物法预处理技术所参考的科学文献大约有4 400多篇（主要为期刊论文、会议、报告、图书等，不包括专利引用），通过被引次数指数曲线和加权指数曲线共筛选出核心参考论文293篇，大约占到整个参考论文总数的 6.6%左右。核心参考论文产出国以美国为主，占了总参考论文的 36%，另外丹麦、瑞典、日本、加拿大、芬兰也有一定量的核心论文产出。核心参考文献的研究方向主要集中在嗜热细菌、高固态原料直接发酵、铜离子依赖糖苷酶GH61家族、相关的原理与降解模型等。

表3 部分被专利参考的代表性核心论文

（续表3）

2 核心专利技术

在专利数据中，针对具体的技术领域会形成一个专利群，专利群中每件专利根据其价值和作用分为核心专利、重要专利和一般专利，其中核心专利处于专利群的核心位置和节点地位，对整个专利研发的走向起重要作用，并最终影响产业的发展[14]。

本文通过INNOGRAPHY的专利强度特征指标和被引用指标选择出纤维素生物法预处理技术的核心专利数据，结果表明，核心专利主要集中在美国、欧洲专利局、世界专利组织等，其中美国无论在核心专利优先权，还是同族专利数量方面都高于其他国家和地区。主要研发企业包括诺维信、加拿大IOGEN、荷兰帝斯曼、DYADIC国际等，上述四家企业的核心专利占全部核心专利量的80%。

纤维素生物降解核心专利涉及到高效菌株选育技术、组合酶及其构建方法、酶性能增强、遗传工程及其载体表达、联合协同处理技术等方面。组合酶及其构建方面，DYADIC国际通过酶促水解纤维素构建高效纤维素酶组合物[15]，能高效地将生物质木质纤维素（涉及到常见的各种木质纤维素材料，包括自然界植物、农作物木质纤维素、工业废弃物等）转化为葡萄糖。诺维信[16]研发的酶组合物包括烟曲霉纤维二糖水解酶Ⅰ、烟曲霉纤维 二糖水解酶Ⅱ、烟曲霉 β-葡糖苷酶或其变体、具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽等。

高效菌株选育技术方面，MASCOMA[17]培育菌株既可以产生水解纤维素、半纤维素、木质素与碳水化合物之间连接的酶，也可以直接通过高固态直接生产乙醇等产品，并且减少在同时糖化和发酵（SSF）过程中水解生物质原料所需加入的外源酶量。DSM I P[18]的Talaromyces突变菌株能高效分解木质纤维素材料生产生物产品，分泌 CBHⅠ、CBHⅡ、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白、EG/GH61等酶。

遗传工程及其载体表达方面，Novozymes Inc[19]通过研发具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸，如棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶活性多肽[20]，构建载体和宿主细胞。

酶性能增强方面，诺维信研发了增强纤维素材料降解或转化的方法，在具有纤维素分解增强活性多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料，组合酶包括半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀素等[21]；也研发了通过非催化性碳水化合物结合组件（CBM）增强糖基水解酶家族61（GH61）的相关技术[20]；另外诺维信研发了通过酶活性增强酶组合物在高温条件（54℃～70℃）下分解纤维素材料[22]。

3 结语

纤维素降解生物法预处理总体上还处于发展期，研发力度有限，与其他物理化学法、化学法等预处理方法相比生产成本还处于较高水平，酶解效率也有待提高。目前全球研发重点有两个，一是选育分泌高效降解组合酶的菌株，二是通过遗传工程对降解木质纤维素起作用的基因片段进行基因改造，从而提高降解效率。

美国纤维素降解生物法预处理专利技术研发特征是以企业为主，研究型机构在基础研究上进行配合的局面，有相应的政策规划和产业化示范。中国纤维素降解生物法预处理研发以研究型机构为主，产业化示范有限，研发基础也相对薄弱。

纤维素生物降解产业化涉及诸多因素，除了技术层面的问题，还与诸如因素包括原料（如稳定的原料价格）、物流交通状况、生物产品高价值化、生物产品多样化、以及其他相关配套产业的发展等有较大关联，发展纤维素生物降解产业任重而道远。

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