纤维素降解菌的筛选、酶活及对稻草秸秆的降解研究1

刘 最， 何丽芳， 陈晓华， 滕 涛， 李玉中*

（衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008）

我国是农业大国，年产农作物秸秆约5.7亿吨以上，占世界秸秆总产量的20%～30%[1]。因此，秸秆是我国极为丰富的可再生资源。在水稻产区，稻草秸秆占农作物秸秆的绝大部分。秸秆还田技术是当今世界范畴内改善农田生态环境、发展现代农业、促进绿色食品产业和农业可持续发展的重要措施[2]。但秸秆在自然状态下降解缓慢，阻碍了这一措施的推广和实施。目前绝大部分稻草秸秆仍然被焚烧，不仅对环境造成了一定的污染[3]，同时也存在一定的安全隐患。另外，由于秸秆的焚烧导致土壤营养成分的丢失，使用额外的化学肥料或农家肥料来补充，从而造成更为严重的二次大气污染[4]。

因此，如何快速降解秸秆成为解决秸秆还田的关键。秸秆降解缓慢的主要原因是其内含有大量的纤维素，纤维素的降解速度决定了秸秆还田的速度[5]。目前，关于纤维素降解的方法常见的有化学降解法、物理降解法和生物降解法。而生物降解法具有独特的优势，如安全环保、降解速率高、成本低等优点。因而，纤维素降解菌的分离、筛选和酶活性的测定成为当前研究的一大热点[6-10]。

为了加速秸秆还田，促进农业生态的可持续发展，有必要筛选稻田纤维素降解微生物，以期用于稻田秸秆的还田。同时，解决当前惯用的焚烧法处理稻草秸秆所造成的环境污染问题。目前，国内外分离筛选出的纤维素降解真菌主要集中在木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属等丝状真菌[11]，但关于冬克青霉降解纤维素的研究还未见报道。并且关于该菌株的相关研究报道少，《中国真菌志》记载冬克青霉为罕见菌种，不易分离，在我国上海和湖北神农架鲜有分布[12]。

本文从富含纤维素的土壤中采集土壤样本，分离和筛选纤维素降解菌株，为高效处理农作物秸秆等纤维素资源及秸秆快速还田提供新资源。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 样本

在衡阳市郊区及祁东县采集稻田土壤样本，并编号，实验样本编号及采集地点如表1所示。

表1 样本采集信息

1.1.2 培养基

富集培养基（滤纸条液体培养基）：(NH4)2SO43.0 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，KH2PO41.0 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.001 7 g，CaCl20.1 g，CoCl20.002 g，NaCl 0.1 g，蒸馏水 1 000 mL，pH值6.5。

筛选培养基（刚果红纤维素琼脂）[11]：KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，琼脂14 g，明胶2 g，纤维素粉1.88 g，刚果红0.2 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。

PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，自然pH。

种子培养基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏10.0 g，KH2PO42.0 g，(NH4)2SO41.5 g，蒸馏水1 000 mL。

液体发酵培养基：CMC-Na 5 g，蛋白胨3 g，牛肉膏1 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH。查氏酵母膏琼脂（CYA）[12]：

1）查氏浓储液备用：NaNO330 g，KCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水 100 mL。

2）CYA配方：K2HPO41.0 g，查氏浓储液10 mL，酵母膏5 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，水1 000 mL。

稻草固体培养基：将稻草秸秆剪成约1 cm的小片段，用自来水洗涤后进行40目的过筛处理，随后将其置于鼓风干燥箱中烘干至恒重，进行压制处理后均等分装于洁净的广口培养瓶中（每瓶3 g），再分别加入12 mL的水。盖上盖子湿热灭菌。

1.2 方法

1.2.1 菌株富集培养及分离

称取采集的各样本5 g，加至装有无菌玻璃珠的三角锥形瓶中，加入50 mL无菌水充分混合均匀，摇床充分振荡20 min，用灭菌纱布过滤，静置1 h，取上清液 1 mL接种于富集培养基中，220 r/min、28℃培养 5～7 d，使纤维素降解菌富集，并观察记录滤纸条的降解情况。取滤纸条降解的样品悬浮液各 0.1 mL，分别涂布接种到加有0.01%青霉素和0.01%农用硫酸链霉素的PDA培养基平板上，25～26℃培养72 h，观察菌落生长情况，并进行纯化保藏。

1.2.2 纤维素降解菌株的筛选

将分离纯化的菌株转接至刚果红纤维素琼脂培养基中，每皿3点，30℃培养4 d。若该菌产生纤维素酶，菌落周围则会出现透明圈，用十字交叉法测量各菌落直径（d, mm）和透明圈直径（D, mm），依据D/d值大小来选择产酶菌株，选取比值大的菌株进行后续研究。

1.2.3 菌株形态学鉴定

采用三点接种法和插片法将菌株1-4接种到鉴定培养基（CYA）上，于30℃恒温培养箱中培养7 d，观察菌落的形态，显微镜下观察菌丝大小、孢子梗及孢子等形态，参阅《中国真菌志》[12]描述进行形态鉴定。

1.2.4 菌株1-4 FPAase的测定

粗酶液制备：将菌株1-4接种到种子培养基中，30℃，180 r/min培养3 d，取2 mL接种于装有100mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中。30℃，180 r/min培养4 d，吸取8 mL发酵液，4℃条件下4 000 r/min离心10 min，所得上清液即为粗酶液。

滤纸处理：使用前将其用1%的醋酸溶液浸泡24 h以除去淀粉，用碘液检验，再用2%的NaHCO3溶液洗至中性，晒干。

酶活测定：根据DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法测定总纤维素酶活力即滤纸酶活（FPAase）[13-14]。将50 mg经预处理的定性滤纸放入25 mL比色管中，加入1 mL粗酶液，加1 mL CMC-Na的柠檬酸缓冲液（pH值5），以不加粗酶液反应作为空白对照，50℃恒温水浴中反应60 min，加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷却停止反应，定容至10 mL，于540 nm波长测定其OD值。在上述测定条件下，每分钟1 mL酶液催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示[15]。

1.2.5 菌株1-4对稻草的降解效果

用无菌生理盐水洗脱下PDA上培养7 d的青霉1-4的孢子，将孢子配制成5×106个/mL浓度的悬浮液。取3 mL青霉1-4孢子悬浮液加入到灭菌稻草固体培养基。以加3 mL无菌水为对照。接种后28℃恒温培养，在培养7 d、14 d和21 d时，分别取3瓶观察稻草降解情况并按照薛惠琴等人[16]的方法测定稻草中纤维素的含量。在21 d时，取少许稻草秸秆用乳酸酚棉兰染液对其进行染色处理，在显微镜下观察稻草秸秆中菌株的生长及分布情况，并拍照记录。

2 结果与讨论

2.1 纤维素降解菌株的分离与初筛

富集培养6 d后，6组样本中的4组滤纸条有明显的崩解现象，从这4组中用涂布平板法共分离得到16株具有纤维素降解活性的真菌菌株。（详见表2）。

表2 各类土样中降解菌株的分离情况

2.2 纤维素降解菌株的复筛

刚果红纤维素琼脂培养基点接的16株纯化真菌，从第 3 d 起菌落周围开始出现透明圈，编号为1-4、6-2、6-3的 3 株菌透明圈较为明显。其中，菌株1-4的菌落较小，生长规整、圆形，透明圈最为明显和清晰，其透明圈和菌落直径比值最大，为1.22（表3）。菌株6-2、6-3菌落生长不规则，其菌落周围有一定的透明带，但带很窄（图1）。从以上结果看，菌株1-4为分离到的降解纤维素能力最强的菌。

表3 筛选所得菌株透明圈与菌落直径

图1 3株复筛菌株在纤维素刚果红培养基上产生的透明圈

2.3 菌株1-4的形态鉴定结果

菌株1-4在PDA培养基上培养4d后菌落形态呈圆形絮状，中心脐状突起边缘整齐，初期为灰绿色，粉末状（图 2a）。在查氏酵母膏固体培养基上生长时，菌落呈放射状或有脐状突起；质地绒状，初期呈白色，后期颜色转暗（图2b）。

图2 菌株1-4的形态学特征

菌株营养菌丝体无色、有横隔，分生孢子梗亦有横隔。其生于基质或气生菌丝，孢子梗(40～70)－(200～250)×(2.0～3.0) μm，壁平滑，帚装分枝顶端具有膨大的顶囊，达4.5 μm；帚状枝单轮生，偶有梗基状分枝；瓶梗每轮5～12个，8.0～10.5×2.2～3.0 μm（图2c）；在400倍显微镜下观察到该菌株的分生孢子近球形或球形，直径2～2.5 μm，壁光滑；分生孢子链呈现较疏松的圆柱状（图2d）。经形态鉴定，该菌株为类曲霉亚属的冬克青霉（Penicillium donkii）。目前关于该菌株的相关研究报道少，《中国真菌志》记载冬克青霉为罕见菌种，不易分离，在我国上海和湖北神农架鲜有分布[12]。

2.4 菌株1-4 的FPAase

液体发酵培养 5 d后菌株 1-4的 FPAase为 11.2 U/mL，之后酶活力随着发酵天数延长而增大，在第8 d天，酶活最大为15.0 U/mL，之后又开始减小（如图3所示）。可作为一株具有潜力的纤维素降解菌。但要用于工业生产须对该菌株的产酶条件进行优化，理化性质进行深入研究，以获得更高的纤维素降解能力，以进一步提高其利用价值，对实现经济的可持续发展具有重要意义。

图3 培养时间对菌株1-4总纤维素酶活性的影响

2.5 菌株降解稻草效果

经观察，培养7 d后，有少量的菌苔多生长于稻草秸秆两端的切口处，中间部位几乎未见菌株生长。培养到14 d时，菌株的生长情况明显较第一周茂盛，而且菌落的颜色明显有所加深。除了秸秆切口处生长有浓密的菌落外，其中间部位也可见少量菌落生长。培养到21 d时，秸秆中间部位也生有较多的菌落。加入无菌水的对照组的稻草培养基中无明显的变化。（图4a～4d）。

经染色后在 10×40倍显微镜下观察发现，菌株大多生长于稻草秸秆端部的切口处，中间部位则分布有繁密的且杂乱的纤细菌丝体。菌株的染色较浅，分生孢子梗颈较短小，孢子梗上残留的孢子穗数量也较少。（图 4e、4f）

图4 菌株1-4在稻草秸秆上的生长情况

连续培养21 d后，对照中的纤维素含量由30.3%变为29.91%，而接种菌株1-4的处理中稻草纤维素含量由接种前的30.3%减少至26.36%（如图5所示）。说明菌株1-4对稻草秸秆中的纤维素具有一定的降解能力。研究发现，菌落多出现在稻草秸秆的切口处。依据此特点，在秸秆还田中，可将稻草秸秆处理的更碎以产生更多的切口，以利于菌株更好地生长，加快秸秆的降解。同时也可人为的培养该菌，将其和秸秆混施入土壤，提高菌量加快秸秆的降解速度。

3 结论

图5 稻草培养基中纤维素含量与发酵时间关系图

本研究以筛选纤维素降解菌，加速秸秆还田为目的，从富含纤维素的样本中分离出16 株真菌，通过纤维素刚果红平板法复筛获得3株可产生较明显透明圈的真菌菌株（编号为1-4、6-2、6-3）。依据D/d值大小来选择最终确定菌株1-4为最具纤维素降解能力的菌株，观察菌株1-4在PDA和CYA培养基上的菌落形态特征和菌体显微结构，经形态学鉴定为冬克青霉（Penicillium donkii），该菌为类曲霉亚属真菌。该菌在28℃，180 r/min生长第8 d时出现最高值，其总纤维素酶活为15.0 U/mL，该菌对稻草秸秆中纤维素的降解有一定的促进作用。

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