植物J蛋白的生物学功能及其作用机制

张驰，刘丹丹，刘建中

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321000）

1 植物J蛋白的结构与分类

J蛋白，亦称DnaJ/Hsp40s蛋白，是一类保守的Hsp70s辅助分子伴侣蛋白家族[1-2]。J蛋白包含一个标志性的、高度保守的、大约70个氨基酸的J结构域。J结构域由4个α螺旋和1个HPD模块（含保守的His、Pro、Asp序列）组成[2]。按所含结构域划分，J蛋白可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚型[2]（图1）。Ⅰ型J蛋白具有4个结构域：α螺旋状的J结构域、G/F（甘氨酸/苯丙氨酸）结构域、CXXCXGXG锌指结构域及羧基末端区；Ⅱ型J蛋白没有锌指结构域；Ⅲ型J蛋白只含J结构域。另外，还发现Ⅳ型J蛋白，亦称类J（J-like）蛋白（图1），它的结构和序列与J结构域相似，但不包含HPD模块，如拟南芥JLP2（J-like protein 2）的HPD模块被His、Val、Asp序列（HVD）所取代。

图1 J结构域蛋白的4种类型[2]Fig.1 Four types of J-domain proteins[2]

在拟南芥中，共发现120个J结构域蛋白，这些J蛋白具有不同的亚细胞定位，并参与不同的生物学过程[2]。根据生物信息学分析，在J蛋白所携带的信号肽中，预计有50个J蛋白定位在细胞质中，9个定位在内质网上，19个定位于线粒体内，12个定位在叶绿体中，3个定位于细胞骨架上，1个定位于质膜上，24个定位在细胞核上，2个定位在液泡中[2]。J蛋白亚细胞定位的多样性可以反映出其功能上的多样性。然而迄今为止，只有为数不多的植物J蛋白的功能被确定。

2 植物J蛋白的基本作用机制

Hsp70s是生物体中最重要的分子伴侣蛋白之一，参与蛋白质的折叠、跨膜运输及降解调控等生物学过程，在生物体对逆境胁迫的抵抗及适应方面起着重要作用。Hsp70蛋白有2种结合状态：ATP结合态（Hsp70-ATP）和 ADP结合态（Hsp70-ADP）。Hsp70蛋白有2个结构域：ATP酶/核苷酸结合域（ATPase/nucleotide binding domain,NBD）和底物结合域（substrate binding domain,SBD）。在ATP结合态中，Hsp70以相对较弱的亲和力通过SBD直接结合底物蛋白，但这种结合底物很容易脱落；通常，Hsp70与底物蛋白的结合是在J蛋白的帮助下完成的。J蛋白可通过其锌指结构域或C末端结构域与非正常折叠的底物蛋白结合，并通过与Hsp70互作而将底物蛋白转至ATP结合态的Hsp70中；还可通过其J结构域与Hsp70蛋白互作激活Hsp70的ATP酶活性[3]；ATP水解成ADP后，造成Hsp70构象的变化，即α-螺旋盖关闭，使HSP70与底物蛋白紧密结合，J蛋白从Hsp70-ADP上脱离；与此同时，利用ATP水解释放出的能量可帮助底物完成正确折叠；核苷酸交换因子（nucleotide exchange factor,NEF）与Hsp70结合，催化ADP的解离；ADP解离后，ATP重新结合在Hsp70的ATP水解酶结构域上，诱导α-螺旋盖打开，从而释放出正确折叠的底物，而结合ATP的Hsp70又可用于进行下一轮的底物蛋白折叠过程（图2）[4]。因此，在胁迫条件下，J蛋白在维持细胞内蛋白的正确折叠与正常功能中起着重要作用。除了Hsp70蛋白辅助分子伴侣的功能外，J蛋白还具有蛋白二硫键异构酶活性，催化二硫键的形成、还原或异构化。

图2 Hsp70:J蛋白互作模式图[4]Fig.2 Diagram of Hsp70:J-protein chaperone cycle model[4]

3 J蛋白的生物学功能

3.1 J蛋白在调控叶绿体功能中的作用

玉米维管束鞘缺陷2（bundle sheath defective 2,BSD2）蛋白调控二磷酸核酮糖羧化酶（ribulose bisphosphate carboxylase,Rubisco）的积累。BSD2功能丧失突变体bsd2-m1不能积累Rubisco大、小亚基，严重影响其光合作用[5]。BSD2编码一个定位于叶绿体的含锌指结构的类DnaJ蛋白，BSD2通过与Rubisco大亚基互作而促进其翻译和/或折叠[5]。另外，BSD2与新生大亚基和/或新输入的小亚基及其他组装成员（RAF1和RAF2）互作，一起组装成Rubisco全酶[6-7]。最近，通过在大肠埃希菌中共表达5个拟南芥叶绿体分子伴侣蛋白实现了Rubisco的功能表达[8]，这5个叶绿体分子伴侣蛋白其中之一便是BSD2。结构与功能分析表明，在Rubisco小亚基可供用于组装成完整的Rubisco前，BSD2在保持由8个大亚基组成的组装中间体的结构稳定性中起着关键作用[8]。该研究为通过基因工程手段提高光合效率、增加作物产量奠定了基础。

PSA2是一个定位于类囊体内腔中含锌指结构并具有蛋白二硫键还原酶活性的类DnaJ蛋白。PSA2功能丧失导致光系统Ⅰ（photosystemⅠ,PSⅠ）复合体中蛋白亚基特异性降低，说明其在维持PSⅠ复合体中蛋白质水平及对PSⅠ的组装或维持中起着关键性作用。在拟南芥中，沉默PSA2后出现叶片斑驳和生长延缓的表型，在psa2突变体中观察到类囊体聚集异常的基粒和发育不良的基质[9]。

在高光强下，植物必需高效保护PSⅡ免受损伤。定位于类囊体内具二硫键异构酶活性的DnaJ锌指蛋白LQY1（low quantum yield of photosystemⅡ1）与PSⅡ核心复合体互作，在修复被光损伤的PSⅡ复合体中起着重要作用[10]。在强光下，lqy1突变体通过PSⅡ光化学反应产生量子的能力及PSⅡ电子传递速率降低，总的非光化学淬灭和光抑制淬灭较野生型高，导致在突变体中积累过量的活性氧；同时，在lqy1突变体中PSⅡ捕光复合体Ⅱ超级复合体的积累量及光合效率也显著下降。PSⅡ修复与重新组装涉及PSⅡ复合体中蛋白二硫键的断裂及形成，LQY1蛋白二硫键异构酶活性在此过程中发挥着重要作用。这些结果表明，LQY1通过调控PSⅡ复合体的修复及重新组装参与强光下PSⅡ活性的维持。

拟南芥sco2或cyo1突变体的表型为子叶白化；SCO2/CYO1仅对子叶中叶绿体发育至关重要，对真叶叶绿体发育无影响[11]。SCO2/CYO1编码一个含保守锌指结构域的类DnaJ蛋白。研究认为，SCO2/CYO1与PSⅠ中的A1和A2亚基及PSⅡ中的CP43和CP47亚基互作，可能是通过蛋白二硫键异构酶活性不断打破及产生新的二硫键，从而加速PSⅠ及PSⅡ亚基的折叠[12]。SCO2/CYO1定位在叶绿体类囊体膜上。核编码的光合相关基因的转录一般不受sco2/cyo1突变的影响，但sco2/cyo1突变体中的光合相关蛋白水平则显著下降，说明CYO1可能参与叶绿体中光合相关蛋白的翻译或翻译后调控[11,13]。另外，SCO2/CYO1可与捕光叶绿素结合蛋白互作，是组装或修复光系统中捕光色素蛋白复合物（light-harvesting complex,LHC）所必需的[14-15]。研究发现，LQY1是与SCO2/CYO1最近的同源蛋白，二者均具二硫键异构酶活性[10,12-13]，也均参与PSⅡ复合体的组装或修复[10,14-15]，但它们在保守半胱氨酸数及互作蛋白上有差异[10,13]。在强光条件下，LQY1与PSⅡ核心单体RCC1和缺少CP43的PSⅡ单体RC47共迁移，表明LQY1在修复和重新组装PSⅡ复合体中起作用[10]，而SCO2/CYO1则与PSⅠ-LHCⅡ和PSⅡ-LHCⅡ形成复合体[15]。另外，CYO1/SCO2功能丧失影响参与类囊体膜建成的转运囊泡的形成、运动，以及这些囊泡与类囊体膜的融合，从而导致类囊体膜形成的缺陷[14]。说明CYO1/SCO2不但参与PSⅡ的组装或修复，还在类囊体膜的建成中起着重要作用。

HCF222（high chlorophyll fluorescence 222）编码一个富含半胱氨酸的类DnaJ锌指蛋白。HCF222对于Cytb6f复合体的成熟或组装必不可少[16]。在hcf222突变体中Cytb6f复合体不同亚基的积累量与野生型相比显著下降，同时在类囊体膜上PSⅡ、PSⅡ光捕获复合体和PSⅠ不同亚基的积累水平也均显著下降。该蛋白具有叶绿体及内质网双重定位。含有质体转运肽的HCF222融合载体能够拯救hcf222突变体缺陷，说明HCF222对于类囊体上蛋白复合体的成熟和/或组装所必需[16]。

拟南芥ANU7编码一个对植物叶片形状发育和色素积累很重要的类DnaJ蛋白[17]。当anu7突变时，叶片成锯齿状并且色素积累明显减少。anu7-1突变可诱导逆行信号，导致许多叶绿体相关基因，包括一些叶绿体基因组编码的基因表达发生改变，而这些基因的突变会导致叶绿体发育及类囊体膜结构和排列发生严重缺陷[17-18]。

叶绿体的复制对维持植物细胞中最佳的叶绿体数目至关重要。ARC6（accumulation and replication of chloroplasts 6）在拟南芥中编码一个定位于质体膜上的类J蛋白，其在质体分裂中起着重要作用[19]。arc6突变体的叶肉细胞仅含有1到2个体积剧增的叶绿体，其中参与质体分裂的2个关键蛋白FtsZ1和FtsZ2表现出定位异常。在野生型中，FtsZ蛋白在质体分裂处组装成一个环形结构，而在arc6突变体中FtsZ则形成由无数短而无序的丝状片段组成的结构。推测ARC6可能通过促进叶绿体中FtsZ环状结构的形成从而影响叶绿体分裂[19]。

Hsp21是定位于叶绿体中的小热激蛋白，参与依赖于质体编码的RNA聚合酶（plastid-encoded RNA polymerase,PEP）的转录。利用蛋白互作手段结合质谱分析，鉴定出质体类核中DnaJ结构域蛋白pTAC5是Hsp21的互作蛋白。Hsp21-pTAC5是PEP复合体中的主要组分，Hsp21-pTAC5二聚体以光依赖方式与叶绿体DNA形成复合体。Hsp21-pTAC5在质体RNA转录起始期、伸长期及终止期均存在于PEP复合体中[20]。说明Hsp21与pTAC5在热激条件下通过维持PEP功能即叶绿体的转录而参与叶绿体发育。

3.2 J蛋白在植物发育中的作用

油菜素内酯（brassinosteroids,BR）是植物生长发育和应对环境胁迫所必需的植物类固醇激素。通过BR合成抑制剂Brz筛选鉴定出拟南芥bil2-1D突变体并克隆到BIL2。BIL2编码一个定位于线粒体、参与蛋白折叠的DnaJ蛋白[21]。BIL2作用于BR受体BRI1的下游，主要通过促进线粒体中ATP的合成而诱导细胞伸长。此外，BIL2还可增强拟南芥植株对盐及强光的抗性。BIL2的J蛋白序列拥有一个 TPR 2（tetratrico-peptide repeat 2）结构域 ，TPR2可介导从Hsp90到Hsp70的底物逆行转移[21]。

开花是植物从营养生长到生殖生长转变的重要标志，受到各种生长和环境信号的复杂遗传途径网络的严格控制。这些调控集中于2个开花通路整合因子FT和SOC1上[22]。J3是拟南芥在多种植物组织中表达的Ⅰ类DnaJ蛋白，可与抑制FT和SOC1表达的关键调节因子SVP互作[22]。J3功能丧失会降低开花整合因子FT和SOC1的表达，从而造成晚花表型。J3蛋白通过直接与SVP结合可减弱其与SOC1和FT调控序列的结合，从而解除其对SOC1和FT表达的抑制[22]。EMF1（embryonic flower 1）是植物多梳蛋白复合体1（polycomb group complex 1,PRC1）的重要组分之一，在组蛋白甲基化修饰、维持及染色质紧缩等过程中起着重要作用[23-24]。植物中与开花相关基因的表达，如FLC及FT受组蛋白甲基化调控[25]。EMF1促进植物营养生长而抑制开花，emf1功能缺失突变体直接越过营养生长而进入生殖生长[26]。EIP9是一个与EMF1在细胞核中互作的DnaJ蛋白，EIP9的时空表达模式与EMF1相似[27]。eip9突变体表现出早花表型，而过表达EIP9则导致开花延迟；突变体或过表达植株中开花时间及花器官身份基因的表达与早花或晚花表现相一致[27]。这些结果说明，J蛋白作为分子伴侣辅助蛋白通过影响EMF1的功能参与开花调控，但其作用的分子机制还有待进一步研究。

拟南芥katamari2（kam2）突变体具有缺陷的内膜结构，如内涵体变形及与不同细胞器形成大的聚集体等。图位克隆证明，KAM2/GRV2编码一个含RME-8（receptor-mediated endocytosis-8）的DnaJ同源蛋白。在动物细胞中，RME-8在质膜到溶酶体的内吞过程中起至关重要的作用。在kam2突变体中出现种子储存蛋白错误分拣现象，表明KAM2/GRV2参与蛋白质向储存液泡的转运。另外，kam2突变体在拐状型胚之前，其子叶在种子内有向相反空间生长的现象。这表明KAM2/GRV2是内膜系统形成、种子储存蛋白向液泡中运输及胚的生长轴方向决定所必需的[28]。

3.3 J蛋白在抗非生物胁迫中的作用

烟草NtDnaJ1是一个Ⅰ型J蛋白，NtDnaJ1受干旱胁迫诱导表达。在拟南芥中，过表达NtDnaJ1可以显著提高拟南芥的抗旱性[29]。AtDjA3编码一个J蛋白，并受盐、葡萄糖及脱落酸（abscisic acid,ABA）诱导表达。与野生型相比，atdja3突变体对盐、葡萄糖及ABA的敏感性增强。Abi3基因的表达在atdja3突变体中升高，而在过表达植株中降低，说明AtDJA3在盐及ABA等参与的非生物胁迫中起着一定的作用[30]。AtDjB1是定位于叶绿体的拟南芥J蛋白家族成员之一。AtDjB1受高盐、干旱等环境胁迫及ABA的诱导表达。AtDjB1的敲除改变了ABA途径中相关基因的表达，暗示其可能通过参与ABA信号途径而影响植物的渗透胁迫耐受性。atj1-1突变体与野生型相比耐热性降低，并在热激后出现抗坏血酸浓度降低及活性氧（reactive oxygen species,ROS）增加的现象，说明AtDjB1不仅参与耐热性，而且也参与细胞内氧化还原状态的调控[31]。

植物的受粉与受精常发生在炎热的夏季，因此，植物必须进化出能够确保在夏季高温下花粉管可以正常生长的机制。拟南芥的DnaJ蛋白TMS1（thermosensitive male sterile 1）在花粉管耐热性中起着主要作用。tms1突变导致在30℃环境下生长的拟南芥植株花粉管伸长阻滞，因而造成严重的雄性不育[32]。另有报道显示，在TMS1中DnaJ结构域与BiP1和BiP3互作并激活其ATP酶活性。TMS1基因的表达在bzip28 bzip60双突变体中下降，说明TMS1可能作用于bZIP28和bZIP60的下游，通过参与非折叠蛋白或错误折叠蛋白的重新折叠或降解而调控植物在花粉中的抗热性反应[33]。

3.4 J蛋白在抗生物胁迫中的作用

烟草Tsi（tobacco stress-induced 1）是一个乙烯响应原件结合蛋白AP型转录因子，在生物和非生物胁迫信号途径中起着重要作用。HAM等[34]通过酵母双杂交筛选出Tsi1的互作蛋白Tsip1。Tsip1是一个含DnaJ结构域的锌指蛋白，其基因受多种生物或非生物胁迫因子诱导表达。Tsip1在正常条件下定位于叶绿体上；而在水杨酸处理下，Tsip1先从叶绿体转至细胞质中，然后通过与Tsi1互作一起转至核内。Tsip1可增强Tsi1介导的转录激活，还可协同Tsi1调控众多与胁迫相关基因的表达。在烟草中，单独过表达Tsip1或Tsi1均可提高烟草对盐及细菌的抗性，同时过表达Tsip1和Tsi1对盐及细菌抗性的增加更为显著；相反，在烟草中沉默Tsip1或Tsi1可降低其对盐及细菌的抗性[34]。

在本氏烟中瞬时过表达大豆Ⅲ型J蛋白编码基因GmHsp40.1可诱导依赖于MAPKKKα和WIPK的类超敏性细胞死亡[35]。在拟南芥GmHsp40.1过表达株系中也出现了类似的细胞死亡或早衰及防御反应激活现象[35]。而在大豆中沉默GmHsp40.1则增强了对大豆花叶病毒的易感性，说明GmHsp40.1在大豆防御反应中起正调控作用。GmHsp40.1的氨基酸序列里有一个核定位信号序列。亚细胞分析表明，GFP-GmHsp40.1定位于细胞核，出现在大小不一的核斑中。GmHsp40.1的核定位对其功能是必需的，当删除该核定位信号或者添加一个核排除信号时，GmHSP40.1便失去了诱导细胞死亡的能力；进一步研究表明，GmHsp40.1与SE（serrated）蛋白在核中有部分共定位，其中SE参与miRNA的加工成熟（从miRNA前体加工成miRNA的过程）及前体mRNA的选择性剪切[35]。暗示GmHsp40.1可能通过参与以上2个生物学过程调控细胞死亡与免疫反应。

Tm-22是一个对番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）具极端抗性的CC-NBS-LRR抗病基因，可通过识别这2种病毒的运动蛋白（movement protein，MP）而引发抗性。DU等[36]通过酵母双杂交筛选发现，Tm-22可直接与本氏烟Ⅰ类J结构域蛋白NbMIP1、烟草属病毒的MPs及SGT1互作。沉默NbMIP1可破除Tm-22介导的对ToMV及TMV的抗性，该抗性的破除是由于NbMIP1s沉默株中Tm-22蛋白水平降低所致。另外，沉默NbMIP1也可破除其他R基因介导的抗性及非寄主抗性，说明NbMIP1s作为辅助分子伴侣在维持R蛋白及其他抗病相关蛋白稳定性中起着至关重要的作用。

马铃薯病毒X（Potato virus X,PVX）基因组中的颈环1（stem loop 1,SL1）RNA对PVX的复制和运动至关重要。CHO等[37]发现，在本氏烟中NbDnaJ可专一性结合SL1负链RNA，并与PVX的外壳蛋白CP互作，过表达NbDnaJ可抑制PVX的复制与运动。说明NbDnaJ通过与SL1（-）RNA及CP互作而抑制PVX的复制与运动。

HOFIUS等[38]利用酵母双杂交从烟草中筛选到与马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）外壳蛋白CP互作的类DnaJ蛋白NtCPIP2a。在烟草中过表达J结构域删除的NtCPIP2a可增强对PVY的抗性。这种抗性的增强是延缓了PVY病毒在烟草细胞至细胞间运动的结果，说明NtCPIPs是PVY病毒侵染的易感因子。PVY借助寄主分子伴侣系统完成病毒的组装或在寄主细胞间的运动。同样，HOFIUS等[38]利用酵母双杂交从烟草中也筛选到了与烟草花叶病毒运动蛋白MP互作的类DnaJ蛋白NtMPIP1。利用病毒诱导的基因沉默技术沉默NtMPIP1能够显著抑制TMV的扩散。因此，认为TMV运动蛋白是通过与寄主因子NtMPIP1互作而促进TMV在细胞间的运动[39]。

拟南芥BIR1是免疫反应的负调控因子。bir1-1突变体具有依赖于SOBIR1的自发性细胞死亡及防御反应持续激活表型。SUN等[40]研究表明：定位于内质网中的一个类DnaJ蛋白Erdj3b的突变可抑制bir1-1中出现的自发性细胞死亡及持续激活的防御反应；在erdj3b突变体中SOBIR1蛋白的积累下降。说明内质网质量控制在SOBIR1的积累及免疫反应中起着重要作用。

在拟南芥及本氏烟中，Hsp70的功能对于细菌基础抗性而言是必需的[41]。Hopl1是假单胞杆菌中含Ⅲ型J结构域的一个毒性效应子。HopI1定位于叶绿体，可导致叶绿体类囊体结构重塑，抑制水杨酸的积累，从而达到增强细菌致病性的效果；J结构域是HopI1介导的细菌毒性和类囊体重塑所必需的；且试验证明，植物Hsp70是致病性假单胞杆菌HopI1的主要靶标，可通过C端J结构域结合Hsp70并激活Hsp70的ATP水解酶活性；在被侵染的植物细胞中，HopI1与植物细胞质中的Hsp70形成复合体，并将其运至叶绿体内[42-43]。总之，HopI1在促进假单胞杆菌致病性中具双重功效：一是在叶绿体中抑制水杨酸的积累而降低水杨酸介导的抗性；二是通过将细胞质中的Hsp70运输至叶绿体而避开由Hsp70在细胞质中介导的防御反应。

近年来，植物J蛋白功能研究进展的简要总结见表1。

4 展望

J蛋白是近年来植物领域受到广泛关注的一类具有重要功能的蛋白质。它们参与植物的叶绿体发育与功能维持、向地性与向光性、从营养生长到生殖生长的过渡，以及对生物及非生物逆境胁迫的抗性等。从以前的研究中可以看出，J蛋白家族中的不同成员可单独完成不同生物学过程中的不同任务，也可在相同生物学过程的不同步骤间通过不同底物蛋白协同完成同一任务。虽然J蛋白的新功能不断被报道，但仍有很多尚未回答的问题。比如，在拟南芥基因组中仅有120个J蛋白，但参与不同生物学过程的蛋白数远多于J蛋白数，那么J蛋白底物专一性如何确定，是否需要其他辅助因子共同决定底物专一性，以及J蛋白有些家族成员所拥有的质体和细胞核双定位，是通过协同完成同一生物学任务还是在不同亚细胞位置执行完全不同的功能等，都亟待进一步研究。J蛋白既可作为Hsp70的辅助分子伴侣，同时又具有蛋白二硫键异构酶活性，因此，区分J蛋白在某一生物学过程中是通过辅助分子伴侣还是二硫键异构酶发挥作用也是未来需要回答的问题。J蛋白不同家族成员在抗病毒方面起着截然相反的作用，有的成员参与抗病毒反应，而有些则被病毒利用来增强其侵染性，造成这种差异的分子及结构机制仍不清楚。而阐明J蛋白在抗病毒方面差异的分子及结构机制，便可以设计出只具抗病毒效应而不具增强病毒致病性效应的J蛋白，为通过基因工程手段创制出抗病毒农作物品种奠定基础。可以预测，随着研究的不断深入和研究手段的不断更新，J蛋白在更多生物学过程中的作用将被揭示，而这些新的发现将有助于从新的视角改良农作物的性状。

表1 植物J蛋白功能研究总结Table1 Summary of J-domain protein functions in plants

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