采用植物组织培养消毒技术分离河口地区香蕉内生真菌的初步研究

张建春 柳青 李春 李芹

摘 要 对河口地区主栽的不同品种香蕉分3条线路进行样本采集，对采集到的香蕉组织进行内生真菌分离、鉴定，共分离到9属494株内生真菌。鉴定结果表明，刺盘孢属（Colletotrichun sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、青霉属（Penicillin sp.）为优势菌群。这3种优势菌群在东部路线、中部路线、西部路线的分离频率分别为78.37%、79.55%、76.54%；在巴西蕉，威廉斯，红研一号、红研二号中的分离频率分别为84.19%、77.32%、79.60%、71.48%。表明香蕉植株组织内内生真菌具有多样性，为进一步研究提供基础数据。

关键词 河口 ；香蕉 ；内生真菌 ；物种多样性

分类号 S668.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.015

Abstract The sample collection of different varieties of Banana was carried out from 3 lines， the endophytic fungi from the tissue specimens was isolated and identified. About 494 strains of endophytic fungi were obtained， they could be classified into 9 genera. Colletotrichun， Aspergillus and Penicillin were dominant fungi. The isolation frequency of these three dominat fungi in the eastern direction， central direction and western direction were 78.73%， 79.55% and 76.54%， respectively. The isolation frequency were 84.19%， 77.32%， 79.60% and 71.48% in varieties of BaXijiao， Weilians， Hongyan 1 and Hongyan 2. It was concluded that the endophytic fungi species of Banana plants in Hekou area had great diversity，which could provide references for the further research.

Key words Hekou ； banana plants ； endophyticfungi ； species diversity

内生真菌是一类生活在健康植物组织内，不引起明显病害症状的微生物。国内外有关香蕉内生真菌的研究很少。2003年曹理想[1]采用分离法对华南地区健康香蕉根、叶内生真菌及放线菌进行了研究，杨佩文等[2]对云南不同地区香蕉根际内生真菌进行了分离，得到了93株内生真菌，并对次生代谢产物进行了抑菌圈活性测定实验。2012年王宇光[3]对海南省香蕉内生细菌进行了分离，得到了一株编号为KKWB-10的内生菌，该菌对镰刀菌四号小种具有一定的抗性。然而，河口地区香蕉植株组织内生真菌的研究尚属空白。多年香蕉病害研究发现，同一地区不同品种或同一品种不同地区香蕉抗病性都不一致，推测可能是由于内生真菌的专一性和多样性起关键作用。本文通过对河口县不同地区、不同品种香蕉植株内生真菌进行分离、鉴定，探讨寄生在香蕉植株组织内的内生真菌是否具有寄主专一性及物种多样性。

1 材料与方法

1.1 材料

按照河口“V”字型地形及海拔走势，结合香蕉种植区的分布，主要选择巴西蕉、威廉斯、红研一号、红研二号4个香蕉品种，东部、中部、西部3条大面积种植香蕉的路线为研究对象（东部路线选择南溪镇马多依到龙堡村委会；中部路线选择蚂蝗堡农场到南溪14队；西部路线选择坝洒农场6队到坝洒农场7队香蕉种植基地[4]。为了保证所取样本能够更全面代表河口地区，除以上3条主线外，其他地区也会随机采集相关材料），进行分离鉴定。

分离用培养基为PDA培养基和查氏培养基。

PDA培养基（1 000 mL）：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

查氏培养基（1 000 mL）：硝酸钠2 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁 0.01 g，蔗糖30 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

采集不同生长时期香蕉植株组织（香蕉根、假径、叶），先对样品进行预处理和表面消毒。具体方法：取新鲜、无虫害的组织用肥皂水刷洗，清水冲洗干净后，用消毒纸巾吸干水分，然后用75%酒精擦拭组织表面，无菌水冲洗3～4次，0.1%升汞浸泡10 min，无菌水冲洗6～7次。在无菌操作条件下用灭菌解剖刀将香蕉组织切成0.5 cm×0.5 cm的小块，盛于灭菌的培养皿内，备用。

1.2.2 内生真菌分离纯化

将上述表面消毒处理过的香蕉组织小块分别接种于PDA、查氏分离培养基平板上，置于25℃恒温箱培养。2～3 d后，待边缘长出菌丝，用接种针挑取边缘生长良好的菌丝，接种在新的培养基平板上，待新接种的菌絲长成菌落后，再挑取边缘的菌丝培养。如此反复，得到纯化的菌株，同时观察记录菌落的生长情况及特征。挑取形态不同的菌落，转入到PDA斜面培养基上，22～27℃条件下纯化培养，保藏备用[5]。

1.2.3 菌株的鉴定

从纯化数日的菌落上挑取菌丝连同孢子制成玻片，置于光学显微镜下观察菌丝、孢子梗、孢子形态、孢子与营养体之间的着生方式，参照魏景超的《真菌鉴定手册》和其他相关资料进行鉴定，对不产孢菌落进行人工诱导产孢。

对诱导仍不产孢的菌落提取DNA，进行PCR扩增、测序，使用Vector NTI软件与GenBank相关序列进行序列比对，鉴定其分类地位。

菌株分离频率采用以下公式计算：

2 结果与讨论

2.1 分离到的内生真菌鉴定结果

所分离得到的内生真菌通过提取DNA，进行PCR扩增、测序，测序结果与GeneBank中已知序列进行比较，结果如表1所示。

由表2可知，三条路线上优势菌群相同，均为刺盘孢属、曲霉属和青霉属，但分离频率有所差别。刺盘孢属中部和西部一样（41.39%），东部最低（38.62%）；曲霉属在中部路线分离频率（25.72%）高于东部（23.13%）、西部（20.43%）；青霉属在东部中最高（16.62%），西部次之（14.72%），中部最低（12.44%）。

2.2 相同路线不同品种分离到的内生真菌情况

东部路线共分离得到149株内生真菌，其中巴西蕉、威廉斯、红研一号、红研二号4个品种组织中分别分离到7属31株、7属36株、7属38株、8属44株内生真菌。刺盘孢属（Colletotrichun sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、青霉属（Penicillin sp.）为优势菌群，其在4个香蕉品种组织中分离频率分别为38.62%、23.13%、16.62%和9.65%。4个品种香蕉组织中均分离到拟青霉属（Paecilomyces sp.），其中红研二号中分离频率远高于其他品种，为15.38%。

中部路线共分离到160株内生真菌，其中巴西蕉、威廉斯、红研一号、红研二号4个品种组织中分别分离得到7属36株、8属40株、7属41株、8属43株内生真菌。刺盘孢属、曲霉属、青霉属为优势菌群，其在4个香蕉品种组织中分离频率分别为41.39%、25.72%、12.44%和9.35%。

西部路线共分离到185株内生真菌，其中巴西蕉、威廉斯、红研一号、红研二号4个品种组织中分别分离得到8属42株、9属46株、9属44株、9属52株内生真菌。刺盘孢属、曲霉属、青霉属为优势菌群，其在4个香蕉品种组织中分离频率分别为41.39%、20.43%、14.72%和10.12%。紅研二号中分离得到8株拟青霉属内生真菌，分离频率为15.38%，远高于其他品种。

2.3 相同品种不同路线分离到的内生真菌情况

表3可以看出，在巴西蕉、威廉斯、红研一号、红研二号4个香蕉品种组织内优势菌群相同，均为刺盘孢属、曲霉属、青霉属，但分离频率上有所差别，刺盘孢属和曲霉属分离频率均为巴西蕉>红研一号>威廉斯>红研二号。青霉属分离频率威廉斯>红研二号>红研一号>巴西蕉。拟青霉属在红研二号组织中分离频率高达15.38%，远高于其他品种，且相对于其他品种，红研二号整个内生真菌群落之间分离频率要小于其他品种之间。

巴西蕉组织内共分离得到109株内生真菌，东部、中部、西部分别为7属31株，7属36株、8属42株，刺盘孢属、曲霉属和青霉属为优势菌群。巴西蕉中三种优势菌群之和在东部、中部、及西部路线的分离频率（CF）分别为83.87%、83.33%和85.36%。

威廉斯组织内共分离得到122株内生真菌，东部、中部、西部分别为7属36株，8属40株、9属46株，刺盘孢属、曲霉属和青霉属为优势菌群。威廉斯中三种优势菌群之和在东部、中部、及西部路线的分离频率（CF）分别为80.55%、77.5%和73.92%。

红研一号组织内共分离得到123株内生真菌，东部、中部、西部分别为7属38株，7属41株、9属44株，刺盘孢属、曲霉属和青霉属为优势菌群。红研一号中三种优势菌群之和在东部、中部、及西部路线的分离频率（CF）分别为76.32%、82.93%和79.54%。

红研二号组织内共分离得到139株内生真菌，东部、中部、西部分别为8属44株，8属43株、9属52株，刺盘孢属、曲霉属和青霉属为优势菌群。红研二号中三种优势菌群之和在东部、中部、及西部路线的分离频率（CF）分别为 72.72%、74.42%和67.31%。

3 讨论

本文分离得到的内生真菌种群和数量上均较少[1，6]，可能是由于所处环境高温高湿，日常分离真菌易出现污染问题。因此，此次分离内生真菌时参考中国科学院西双版纳热带植物园分离榕树瘾头果内生真菌的方法，使用升汞消毒10 min。由于所消毒材料不同，导致消毒时间过长，部分种类内生真菌被杀死，使得内生真菌种类大大减少。

通过河口地区3条线路采集不同品种香蕉植株组织进行内生真菌的分离，共分离得到内生真菌9属494株，其中刺盘孢属、曲霉属、青霉属优势菌群，普遍存在于整个河口地区4个主要品种香蕉组织中。除优势菌群外，还分离到小窦氏霉属、镰刀菌属、交链孢属、痂圆孢属、短梗霉属和少量还无法鉴定出来的真菌，表明河口香蕉植株组织内内生真菌具有多样性。不论是从不同路线还是不同品种香蕉对比，内生真菌群落基本相同，只有分离频率存在差异，但差异不大。可见，同一地区同属植物组织内部环境中，不同微生物的相互作用，会建立某种平衡关系，优势种群相对稳定，分离频率较高，形成了相对稳定的内生真菌群落[7-8]。而稀有种群，当样本量不够大时，可能会被遗漏[6，9]。

红研二号在大田适应性试验种植中，表现出耐叶斑病特性。从分离到的内生真菌来看，红研二号中分离得到的内生真菌种群数量较多。在植物体组织内的微生物群落中，微生物种群数量越多则多样性越高，植物生态系的功能与结构越稳定，则越不易感病[10]。

对整个河口地区不同品种香蕉组织进行内生真菌分离，除少数几份未鉴定出以外，其他已鉴定的均为常见内生真菌，在其他植物组织内均有报道，并未发现特有真菌。因此，目前还不能确定香蕉植株组织中是否存在内生真菌的寄主专一性。随着研究的不断深入及样本不断的采集，可能会发现一些特有的种群，为香蕉内生真菌多样性或寄主专一性提供基础数据。

参考文献

[1] 曹理想，田新莉，周世宁. 香蕉内生真菌、放线菌类群分析[J]. 中山大学学报（自然科学版），2003，42（2）：70-73.

[2] 杨佩文，番华彩，金桂梅，等. 香蕉根际及内生真菌次生代谢产物抑菌圈活性测定[J]. 西南农业学报，2013，26（5）：1 888-1 892.

[3] 王宇光，顾文亮，张 欣，等. 香蕉内生拮抗细菌KKWB-10的分离鉴定及其内生性证明[J]. 中国农学通报，2012，28（24）：183-187.

[4] 杨绍琼，陈伟强，邓成菊，等. 云南河口地区香蕉黑星病与炭疽病发生规律的再研究[J]. 热带农业科学，2015，35（2）：45-50.

[5] 席仪翠，陈吉岳，杨大荣，等. 对叶榕隐头果内寄生真菌的来源[J]. 动物学研究，2009，30（增刊）：154-157.

[6] 王梦颖. 香蕉内生菌多样性分析及广谱拮抗菌筛选[D]. 海口：海南大学，2014.

[7] 李雪玲. 八角莲植株地下茎内生真菌的分离[J]. 云南师范大学学报（自然科学版），2005，25（2）：49-52.

[8] 文才艺，吴元华，田秀玲. 植物内生菌研究进展及其存在的问题[J]. 生态学杂志，2004，23（2）：86-91.

[9] 王利娟，贺新生. 植物内生真菌分离培养的研究方法[J]. 微生物学杂志，2006，24（6）：55-60.

[10] 林时迟，张绍升，周乐峰. 福建省香蕉枯萎病鉴定[J]. 福建农业大学学报，2000，29（4）：465-469.