基于代谢组学的功能性蛹虫草成分研究

王升厚， 牛世莉， 徐方旭， 王 泽， 柳叶飞

(1.沈阳师范大学 实验教学中心，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁 沈阳 110034)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又名北虫草，是虫草属模式种之一，在辽宁省栽培规模极大，每年生产干品约6 000 t，成为区域特色经济的典型代表[1-2]。蛹虫草的有效成分和保健价值早已在众多文献中报导，但目前能够检测的成分种类还十分有限，主要集中在虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、麦角甾醇、SOD酶等[3]。蛹虫草子实体中是否含有其他生物活性成分或有价值的化学物质，一直是虫草行业和药物研究人员希望解答的问题。2017年10月19日，《细胞》杂志子刊《Cell Chemical Biology》在线发表了中国科学院上海植物生理生态研究所王成树老师研究团队的最新研究成果，揭示了虫草素伴随保护分子喷司他丁的生物合成途径[4]。这一发现表明在蛹虫草中的确存在着重要的天然化合物需要进一步发掘，同时也说明我们对蛹虫草的成分认知和保健价值认识还有待提高。代谢组学是一门研究生物体内源性代谢物质的种类、数量及其在内外因素影响下变化规律的学科，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后诞生的一门新的交叉学科，它是系统生物学的重要组成部分，近年来已经迅速成为生命科学研究的热点之一[5-7]。代谢组学通过高通量、高分辨率的分析技术，结合模式识别、专家系统等分析方法，从整体上探讨生命活动在代谢层面的特征和规律，是目前发现潜在活性成分的最佳方法之一[8-10]。鉴于代谢组学技术在生物样本成分体系分析中的优势，本课题组委托北京邦菲生物科技有限公司，对供试的不同类别虫草或不同来源蛹虫草共4个样品进行了非靶向成分体系初步分析，重点研究了功能性蛹虫草、野生蛹虫草、柞蚕蛹虫草和冬虫夏草(Cordycepssinensis)在代谢组学层面的成分差异。功能性蛹虫草概念是沈阳师范大学蛹虫草研究团队2008年提出的，它是以成分指标作为蛹虫草质量标准的评价体系，2016年获得发明专利《一种功能性蛹虫草的培育方法》授权。由于功能性蛹虫草人工培育中需要采用特殊的菌种，独特的培养基配方，以及仿野生的栽培条件，因此所培育的蛹虫草子实体内虫草素含量可以达到很高水平。然而除此之外是否还含有其他有价值的代谢产物，特别是生物活性成分一直是关注的重点。本研究是基于上述目标实施的初步探索，以期为功能性蛹虫草的基础研究和产业开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 采用实验室栽培的功能性蛹虫草为研究对象，以柞蚕蛹虫草、野生蛹虫草及冬虫夏草为对照进行代谢组学分析。供试样品的具体信息见表1。

1.1.2 主要试剂 甲醇(Fisher Scientific，LC-MS级)。

1.1.3 主要仪器 超高效液相系统(ACQUITY UPLC I-Class，美国Waters公司)，质谱仪(Waters SYNAPT G2-S)，高通量组织研磨仪(Coyote-Bio G100)。

1.1.4 分析软件 代谢组学分析软件ProgenesisTM QI及多元统计分析软件EZ-info。

表1 供试样品的相关信息Table 1 Relevant information of the samples

1.2 方法

1.2.1 样品制备 各样本分别称取200 mg，破碎后溶于900 μL 75%甲醇浸提过夜，离心，取上清-20 ℃保存，代谢组学检测备用。取200 g功能性蛹虫草干品送广州分析测试中心备检。

1.2.2 代谢组学检测 由北京邦菲生物科技有限公司执行。色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱温40 ℃，样品温度10 ℃，流动相A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈，进样量1 μL，体积流量0.50 mL/min，梯度洗脱 0～3 min，1%→5%B；3～12 min，5%→60%B；12～15 min，60%→99%B；15～17 min，99%B。质谱条件：采集质量范围为100～1 500 Da，扫描时间为0.1 s，采集模式为ESI-ESI+MSE，Lock mass：Glu-fibrinopeptide(0.3 s扫描，间隔：15 s)，毛细管电压：3 kV(ESI+)/ 2.5 kV(ESI-)；锥孔电压：100 V；碰撞能量(eV)：low CE：6 / High CE：20～45；电离源温度：120 ℃；脱溶剂温度：500 ℃；锥孔气流速：60 L/h。

1.2.3 主要生物活性物质的定量检测 由广州分析测试中心检测，检测方法执行国标或部标。

2 结果与分析

2.1 代谢物聚类分析

通过热图对各虫草样品间代谢物的差异情况进行分析。由图1可以看出，冬虫夏草和柞蚕蛹虫草代谢产物的种类和表达量较为接近，其次是野生蛹虫草与这二者接近。而功能性蛹虫草与这三种虫草之间差异最为显著，表现为代谢产物种类丰富度更高，表达量更高。这是因为冬虫夏草、柞蚕蛹虫草和野生蛹虫草虽然寄主互不相同，但都是以高蛋白质、高脂肪的昆虫幼虫或蛹体为培养基质，在生活方式上都是先行寄生，后转为腐生，因此，在代谢产物种类和表达量上才会比较接近。功能性蛹虫草由于栽培基质主要是小麦和柞蚕蛹浆，从营养角度讲碳源和氮源搭配合理、营养全面，因此其代谢产物种类丰富度才会更高，表达量更高，与其他三者差异更为显著。此外后者的全程腐生方式，可能也是原因之一，因为腐生有利于培养基质的充分分解和代谢产物的合成。

图1 4种虫草代谢产物的聚类分析Fig.1 Four Chinese caterpillar fungus metabolites of cluster analysis

顶端为代谢产物的聚类，横坐标表示供试样品编号，纵坐标表示所有检测物质的分子量/出峰时间；红色代表高表达，绿色代表低表达

The top is the cluster of metabolites, the horizontal coordinates represent the sample number of the sample, and the vertical coordinate represents the molecular weight/peak time of all the detected substances; Red represents high expression and green represents low expression

2.2 供试虫草成分种类的分析

4种供试虫草中成分总计3 045种，不同种类虫草在代谢产物成分种类上存在明显的差异。如图2所示，功能性蛹虫草共检测出产物成分2 213种，占成分总量的72.67%，其特有成分497种；柞蚕蛹虫草共检出产物成分1 857种，占成分总量的60.98%,特有成分279种；野生蛹虫草共检出产物成分1 428种，占成分总量的46.89%，特有成分167种；冬虫夏草共检出产物成分1 024种，占成分总量的33.62%，特有成分108种。供试4种样品全部成分统计结果表明功能性蛹虫草代谢产物种类最多，而且特有成分数量也最为丰富。

图2 供试虫草成分种类的分析Fig.2 Selected Chinese caterpillar fungus species of analysis

2.3 功能性蛹虫草部分汉化产物归类分析

目前大量代谢产物成分尚在解析之中，对目前已经汉化的835种已知成分进行归类分析(表2)，结果表明，835种成分分别隶属于12个不同的物质类别，其中糖苷类、皂苷类和生物碱类占比最高。

2.4 差异最显著物质分析

利用PLS-DA分析得到4种虫草中VIP scores最高的15个差异代谢产物，见图3、表3。实验结果表明，在VIP scores最高的15个差异代谢产物对比中，野生蛹虫草表现出显著的优越性。

2.5 功能性蛹虫草常见有效成分含量分析

功能性蛹虫草常见有效成分的检测委托中国广州分析测试中心完成。表4中数据显示，在已经检测的18项成分指标中，蛹虫草特有成分虫草素含量为5 070 mg/kg，这个数值是目前沈阳地区普通小麦蛹虫草含量均值的3倍。此外，麦角甾醇、SOD酶、维生素E含量分别是对照组的1.27倍、3.56倍和4.49倍。锌和铁两种营养元素含量也分别是对照组的3.3倍和2.56倍。由于功能性蛹虫草栽培中做了富硒处理，因此，子实体中硒含量达到了60.2mg/kg，是对照组的647倍。抗癌药物成分喷司他丁也在本样品自检中获得较高数据，其含量为60 mg/kg。本检测对照组为普通小麦蛹虫草(PTXMC)。

表2 功能性蛹虫草成分归类分析Table 2 Functional ingredients cordycepsmilitaris classified analysis

图3 VIP scores分析Fig.3 VIP scores analysis

横坐标是VIP值，纵坐标是代谢的mg/kg值，颜色由深绿到深红表示各显著代谢物的相对含量

The horizontal coordinate is the VIP value, and the ordinate is the value of mg/kg metabolism. The color is from dark green to deep red, indicating the relative content of each significant metabolite

表3 不同虫草差异显著化合物对比表Table 3 Different Chinese caterpillar fungus compounds significant difference contrast table

注：+的数量代表物质的含量高低

表4 功能性蛹虫草常见化学成分检测结果Table 4 Functional cordycepsmilitaris common chemical composition test results

续表4

3 讨 论

虫草是我国传统的中药资源，特别是冬虫夏草，因其应用历史悠久，文献资料相对丰富。在古代医书中对虫草功效多这样记载：补肾益肺、治诸虚百损、专补命门[11-12]。现代医学研究表明，虫草主要是通过调节人体免疫体系，修复人体受损器官、组织和细胞来实现古人对虫草中医理论的实现途径[13-14]。成分决定功能，含量决定功效，任何一种虫草要想发挥保健价值，一定在其子实体内含有赖以发挥作用的物质基础[15]。本研究在代谢产物层面初步实现了对功能性蛹虫草、冬虫夏草、柞蚕蛹虫草和野生蛹虫草的成分认知，从检测数据分析看，功能性蛹虫草共检测出代谢产物成分2 213种，占成分总量的72.67%，其特有成分497种，与冬虫夏草、柞蚕蛹虫草和野生蛹虫草相比具有显著的成分优势。此外，除目前已经报导的部分成分外，还含有丰富的特殊性代谢产物，无论是哪种虫草其代谢产物成分都十分丰富，但蛹虫草成分丰富度更高些。然而，不同虫草间成分的差异是否会直接导致虫草间保健价值的不同，目前还没有直接证据。另外，本研究主要是采用非靶向代谢组学分析方案，因此，很多成分表达量高低是相对的，如果针对某些重要产物感兴趣，还必须开展靶向代谢组学分析进行定量分析。

相对于代谢组学成分分析数据，传统引用的虫草标志性成分显然是冰山一角，因此试图用一两种已知成分解释虫草进入人体后复杂多样的生理反应显然不够全面，这也是我们多年来一直主张采用全草入“药”的原因所在。由于本代谢组学数据尚在整理之中，本文仅提供了部分比对数据，很多结论尚无法准确给予。希望本研究能对后续的深入研究起到铺垫和引导作用。

参考文献:

[1] 梁宗琦.中国真菌志第32卷[M].北京:科学出版社,2007.

[2] 钱正明,李文庆,孙敏甜,等.冬虫夏草化学成分分析[J]. 菌物学报,2016,35(4):476-490.

[3] 王林萍,余意,冯成强,等.冬虫夏草活性成分及药理作用研究进展[J].中国中医药信息杂志,2014,21(7):132-136.

[4] Xia YL, Luo FF, Shang YF， et al. Fungal cordycepin biosynthesis is coupled with the production of thesafeguard molecule pentostatin[J]. Cell Chemical Bioligy, 2017, 24(12):1479-1489.

[5] Hu XD, Huang X, Wang B, et al. Progress in studies on antitumor and immunomodulatory effect of Cordyceps sinensis[J]. Drug Eval Res, 2015, 38(4): 448-452.

[6] Yang ZL, Hu QX, Li J, et al. Application progress of metabonomics in traditional Chinese medicine[J]. Henan Tradit Chin Med, 2015, 35(1): 204-206.

[7] Jia MQ, Xue Y, Wang Y, et al. Applications of chromatography-mass spectrometry in traditional Chinese medicine metabonomics[J]. J Instrum Anal, 2016, 35(2): 172-178.

[8] 郑文,王诗盛,钟艺,等.基于代谢组学技术的虫草鉴别研究[J].中国现代应用药学,2017,34 (8):1145-1149.

[9] Guo N, Fan B, Peng J, et al. Ultra-performance LC/TOF MS analysis of fruits of Ligustrumlucidum for metabolomic research [J]. Chin J ExpTradit Med Form, 2010, 16(10): 131-133.

[10] Huo JH, Du XW, Sun GD, et al. Analysis on major chemical compounds in exocarp of Juglansmandshuricabased on UPLC-Q-TOF/MS[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(19): 3379-3388.

[11] 孙娜,崔建美,李继安, 等.冬虫夏草的化学成分与药理作用分析研究[J].辽宁中医药大学学报,2015,17(4):65-67.

[12] 朱丽娜,薛俊杰,刘艳芳, 等.蛹虫草子实体中N6-(羟乙基)-腺苷的分离纯化及抗肿瘤作用[J].食用菌学报,2013,20(1):62-65.

[13] 王明奎,丁立生,吴凤锷.两头尖总苷的抗肿瘤活性研究[J].应用与环境生物学报,2008,14(3):378-382.

[14] 涂少臣, 施毅. 香加皮杠柳苷对小鼠骨髓瘤细胞增殖、凋亡及移植成瘤的影响及作用机制[J].福建医药杂志,2017,6(2):6.

[15] 赖筱娟,刘汉清,李俊松,等.丹酚酸药代动力学及成分相互影响研究进展[J].中国新药杂志 2011,20(14):1287-1920.