大鼠膝骨关节炎模型血管增生显微CT观察

安 晓，李志锐，王俊良，孟昊业，汪爱媛，陶 笙解放军总医院海南分院 骨科，海南三亚 5703；解放军总医院 骨科研究所，北京 00853

膝骨关节炎是一种最为常见的疾病，该病症主要症状有关节疼痛、关节活动受到限制以及关节畸形等，这对于膝关节炎患者的生活质量有着较大的负面影响，并且此疾病发病机制尚未明确[1]。有相关研究证实健康的关节软骨下骨中均有血管，不过软骨层中却没有发现。伴有骨关节炎的软骨下骨血管会完全进入到软骨层中，这就会加快软骨退变的进程[2-3]。在骨软骨复合单位中，血管因为增生会出现一种特殊的通道，神经生长因子和炎性因子均能够通过该通道直接进入到关节内环境中，骨关节炎中微血管的变化可能是骨关节炎发病的重要机制之一，对不同病变时期微血管的检测与观察能进一步阐明骨关节炎疾病进展的原因，从而为治疗骨关节炎提供新的方法[4]。目前微血管的检验方法主要是间接检验法，仍缺少一种良好的定量和直观的检验方法。这项研究当中利用显微CT(MicroCT)对骨关节炎各种阶段完成三维成像，利用阈值制订的方法对微血管密度实行进一步的定量检验，便于认定血管增生在骨性关节炎发病机制中的作用。

材料和方法

1 实验动物 在本研究中选取而二十只体质量大致为300 g的雌性SD大鼠，本实验中所选取的大鼠均来自于解放军总医院动物实验中心，并全部都在解放军总医院骨科研究所内进行饲养。

2 相关材料和仪器 这项研究利用的医用碘酊消毒液对来源于卫辉市康宝生化科技有限公司；可吸收缝线(多股抗菌微乔八根针)来源于美国强生公司；不可吸收缝线(10号慕斯线)来源于美国强生公司；亚纳米级硫酸钡来源于上海安亿纳米科技公司；固态明胶粉末是来源北京百灵克生物科技有限公司；Micro-CT Scanner RS-9 system(GE Healthcare公司，美国)；MicroView图像处理软件(GE公司，美国)。

3 大鼠膝骨关节炎模型的创建 在通过解放军医学院实行动物伦理委员会的允许之后，将这项研究所运用的20只体质量300 g的雌性SD大鼠分别分成了实验组(共4组，每组各4只)以及假手术组。全部大鼠都要实行水合氯醛肌内注射麻醉，在麻醉完成之后，全部大鼠都进行手术的消毒，利用脱毛剂均匀的涂抹在大鼠双膝关节表层，并且利用碘酊棉球实行消毒，乙醇棉球实行脱碘。应用无菌手术单和洞巾。大鼠膝关节皮肤手术的切口范围在1 cm左右，在实行切口中显出关节囊，应该确保可以接触到到髌骨。在髌旁中对大鼠关节囊进行侧切，在进入关节腔之后，对其髌骨向外推开，使髌骨外侧处在半脱位的状态，这时候大鼠胫骨平台髁间棘前方的前交叉韧带就会显露出来，对韧带实行切断，并确保该关节屈曲90°。将大鼠膝关节极度屈曲在内外旋后，可以得出胫骨平台以及股骨髁之间的内外侧半月板十分明显，对其实行切除。为了尽可能防止出现异物反应和感染炎症等情况，应该利用抗菌可吸收线对其实行缝合，在对关节囊进行缝合后，使用10号线对大鼠切口皮肤进行缝合。假手术组大鼠在实行常规消毒铺单之后，仅切开了其的关节囊。在等到大鼠麻醉苏醒之后，把大鼠放回到笼中进行饲养，让其进行自由活动。

4 大鼠微血管灌注模型的建立 1)造影剂的配制：将明胶粉末放置在蒸馏水中实行搅拌，进而制作成浓度4%的明胶溶液，并且在50℃恒温水浴箱的状态下将硫酸钡试剂均匀的混合在明胶溶液中，制成浓度30%的硫酸钡混溶液。2)造影方法：大鼠在称重和麻醉之后，将大鼠胸腹部逐一解剖，上侧剖开至大鼠膈肌底层，下侧到膀胱，把大鼠胃肠、肝以及胆囊等气管推移到一侧，使用浓度为0.9%氯化钠注射液纱布对其进行覆盖，一直等到大鼠腹膜完全显露出来之后、大鼠脊椎骨前侧的腹主动脉和下腔静脉同样也彰显出来，实行钝性分离血管膜，血液逐渐彰显出鲜红色并且血管管壁伴有搏动性就是腹主动脉，血液逐渐呈现暗红色即下腔静脉。大鼠腹主动脉在靠近心脏的位置上实行结扎，并且在远心端动脉置管。下腔静脉在流出端实行置管，将注射利用肝素钠和浓度在0.9%氯化钠注射液混合，制作而成的抗凝剂，并持续灌注到大鼠的动脉近心段中，在流出段逐渐展现出清亮无色的时候则为注射终点，对其0.9%氯化钠注射液的用量进行记载，并且注射和0.9%氯化钠注射液相同用量浓度4%甲醛溶液对其的实施标本固定。将水浴箱中的造影剂快速的加压注射在大鼠体内，一直到流出端有造影剂流出当做注射的终点。把灌注后的标本放在-20℃的冰箱中冷冻12 h。

5 取材观察时间点 将实验组大鼠(16只)任意分为A、B、C、D这四个小组，每组大鼠依次在骨关节炎造模术之后的3周、6周、9周、12周实行血管灌注造影。这当中假手术组在12周实行血管灌注造影。取材部位位于内侧胫骨平台。

6 大体观察 对大鼠手术切口实行进一步的审查，是否具有发炎症状，观察大鼠关节囊是否与周边组织出现粘连现象，在进入关节腔之后滑膜组织是否出现糜烂、变性乃至增加等主要情况，关节液容量和颜色，胫骨平台以及股骨髁周边是否有骨赘增生和软骨耗损等。根据相关标准对大鼠关节标本实行整体的评分以及分级：4级代表大鼠软骨厚度缺乏全层，软骨下骨基本暴露；3级代表大鼠部分软骨发生耗损等现象，耗损面积超出软骨总面积的一半甚至更多；2级代表具有十分彰显的软骨裂隙，部分软骨的耗损面积仍要比软骨总面积低一半；1级代表大鼠软骨表层具有轻微的耗损，有少许裂纹；0级表示健康关节软骨，无损伤。

7 显微CT评价 所有的标本在实行显微CT扫描前均在4%多聚甲醛溶液当中实行固定。在扫描前将长方体标准模块(5 cm×1 cm×1 cm)放置在扫描床当中实行校准，尽可能防止初始参数的不一样而出现误差。1)大体扫描：将标本稳固在白色塑料泡沫上进而降低扫描伪影，将扫描精度设为44μm，单次扫描时间设成15 min，在大鼠胫骨平台和大鼠股骨髁的表面选择兴趣区域。三维兴趣区实际上就是大鼠骨软骨复合立方体(5 mm×5 mm×5 mm)，对其精准的坐标进行记录记录。2)精确扫描：将扫描精度设为25μm，并且对其进行加载，对所选用的区域实行进一步的扫描，单次扫描时间为45 min。3)重建与分析：在标本扫描完成之后，其精度在25μm的标准下实行三维图像的组建，将该图像输入在MicroView当中实行进一步的研究。在大鼠标本当中，骨组织CT值一般都分散在1 000 ～ 2 000 HU，所有大鼠标本均是根据1 500 HU当做固定阈值来对骨组织和软组织实行分辨的，并采集兴趣区中的图像。软骨下骨的组织学参数一般包括下列几点：骨小梁厚度(trabecula thickness，Tb.Th)、骨矿化密度(bone mineral density，BMD)、 骨 体 积 分 数 (bone volume fraction，BVF)。因为血管中的硫酸钡造影剂的CT值会比较高，所以所有标本当中均以＞6 000 HU当作阈值对血管实行判定，进一步计算ROI当中的血管体积分数(vessel volume fraction，VVF)，并且在矢状面上对血管实行投影，计算二维界面的最大血管密度(maximum intensity projection，MIP)。对照组采用同样方法计算BMD、BVF、Tb.Th、VVF、MIP。

8 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以-x±s表示，符合正态性及方差齐性者，组间比较采用t进行检验或方差分析，事后检验为LSD法。非正态性数据采用秩和检验；计数资料应用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大体观察 假手术组膝关节软骨所有均是健康软骨，展现出浅蓝色，而且具有光泽，表层没有任何的耗损，且关节液清亮。实验组每一组的大鼠膝关节软骨所有均是不同程度的变化，距离取材时间越久，大鼠关节软骨耗损就越严重。3周组大鼠：大鼠软骨表层失去光泽，色泽展现微黄色，在放大镜下能够看到大鼠软骨微小裂纹的形成，软骨耗损为1级，大鼠关节液清亮，滑膜组织则基本正常。6周组大鼠：大鼠软骨伴有糜烂、表层损害严重和凹凸不平等情况发生，利用肉眼就能够得出裂隙的存在，软骨耗损没有达到2级。9周组大鼠：大鼠软骨的耗损面积超出软骨面积的一半还多，而且大鼠软骨厚度相对较小，有斑片状软骨退化灶情况的发生，软骨耗损为3级，关节液呈现出混浊样，滑膜组织出现增生并且滑膜组织和周围组织粘连情况较为严重。12周组：大鼠软骨全层均发生了耗损的现象，该软骨下骨突出比较显著，而且周边骨赘明显增生，软骨耗损为4级，关节液含量将对较低，滑膜组织逐渐减轻。

2 显微CT评价 1)在骨质量方面，实验组大鼠的Tb.Th、BMD和BVF值均比假手术组低很多；在微血管增生上，实验组大鼠VVF明显要超出假手术组，差异存在一定的统计学意义(P＜0.05)(表1)。2)在骨质量方面，实验每一组大鼠在Tb.Th、BMD、BVF等方面均存在差异，随机两个不同组实行比较，均存在统计学差异(P＜0.05)。C组最低，D组最高。在术后3周、6周、9周，骨质量随着时间一直变小、骨小梁数量以及骨矿化程度都在降低。在术后12周，大鼠软骨下骨骨板发生硬化，大鼠骨质逐渐增多，骨密度较大，骨小梁结构也因此由疏松变得紧密。在微血管增生上，实验随机2组微血管增生实行比较，均存在统计学差异(P＜0.05)，C组大鼠(术后9周)的微血管增生最高(图1为最大密度血管投影，图2为微血管的三维成像)。在手术之后的3周、6周、9周，微血管增生逐渐变快，手术之后的12周，血管增生数量逐渐变少(表2)。

表1 实验组与假手术组骨量与血管增生显微CT分析Tab. 1 Micro CT evaluation of bone and angiogenesis between experimental group and sham group

讨 论

血管增生实际上就是骨性关节炎致病机制中的主要组成部分，它与关节疼痛和肿胀等临床症状有很大的关系，血管增生的精准检测是非常重要的，这不仅可以更进一步探究骨性关节炎的产生以及发展的原理，也可以提供新的治疗的思路[5-8]。目前，对微血管增生实行检测的方法有很多，运用最为普遍的就是墨汁明胶灌注检方法。该方法可以经过墨汁的渗透对血管形态实行观察，不过墨汁极易溶于水，而且利用该方法很难实行切片[9]。伊凡斯兰(EB)显影方法同样也是一种利用最普遍的检测方法之一，EB实际上就是小分子物质，可以进一步进入到微小血管当中，在波长为594 nm下，能够出现红色荧光，所以可以当作标记物，而且还可以进行三维成像，同时其图像分辨率很高。不过此类物质极易溶于水中，无法进行保存，并且必须要冷冻切片[10]。氧化铅还可以当做微血管造影的造影剂，该物质在血管当中分散到比较均

匀，而且不会任意对其他组织间隙实行分散，不过氧化铅当作造影剂的一种成像分辨率相对较低，对环境有一定污染性，易对实验者造成损伤[11]。Microfil实际上就是一种混合硅胶，可以对微血管实行愈加全面上灌注，该材料的成像比较清晰，不过该方法的使用浓度9%的甲酸实行脱钙72 h，这会引起造影剂在微血管中分布不均匀，并且会对微血管有所损害，从而其对增生微血管密度评价的准确性会受到影响[12]。

表2 实验组骨量与血管增生的显微CT分析Tab. 2 Micro CT evaluation of bone and angiogenesis in experimental groups

图 1 各组血管增生最大密度投影1：假手术组微血管增生密度； 2：A组微血管增生密度； 3：B组微血管增生密度； 4：C组微血管增生密度； 5：D组微血管增生密度Fig.1 MIP of different groups1: MIP of sham-operated group; 2: MIP of group A; 3: MIP of group B; 4: MIP of group C; 5: MIP of group D

图 2 各组血管增生的三维重建图像1：假手术组微血管三维图像；2：A组微血管三维图像；3：B组微血管三维图像；4：C组微血管三维图像；5：D组微血管三维图像Fig.2 3D micrangium reconstruction of different groups 1: 3D image of sham-operated group; 2: 3D image of group A;3: 3D image of group B; 4: 3D image of group C; 5: 3D image of group D

经过以上诸多检验方法的描述能够得出，这些方法均能够观察到微血管的形态，不能对微血管实行定量计算。本试验当中所运用的明胶硫酸钡造影剂灌注检验方法，能够依照高分辨率的显微CT对骨性关节炎当中的各种阶段微血管增生现象实行三维立体成像和定量计算，最后对血管增生和骨性关节炎病展的关系实行合理的断定。

骨软骨复合体其实就是经过软骨钙化层和软骨下层所组成的，主要的作用就是吸取关节的负重，并且给软骨提供适当的营养，依照Sanchez等[13]的相关研究能够得出，骨软骨复合体内细胞肥大表型必须具有血清成分的参与，骨关节炎软骨内血管生成很可能是开启了软骨内的成骨阶段，进而致使软骨矿化。但是其研究只是通过病理染色间接推论，并未直接对血管增生进行监测。这项研究经过对大鼠骨关节炎不同阶段骨软骨复合体的显微CT定量研究中能够得出，在骨关节炎初期阶段，骨软骨复合体骨质量一直属于降低的阶段，在术后9周左右达到最低，在术后12周骨关节炎晚期，Tb.Th、BMD、BVF则上升至最高。由于炎性因子的刺激和微血管的侵入所致使软骨下骨板骨小梁遭到损坏和矿物质流失，这实际上就是起初骨质量降低的主要因素，但是在关节炎的晚期阶段，因为关节当中环境的紊乱、长时间病理性所受到的刺激，成骨细胞比较活跃，主要交界的少数软骨钙逐渐变得紧密，提高软骨下骨板的骨密度和骨矿化程度[14-15]。血管增生的变化则与骨质量的变化相反，在骨关节炎早期呈上升趋势，在术后9周达到最高峰，术后12周微血管增生则降至最低，袁雪凌等[4]在兔膝骨关节炎血管增生研究中通过免疫组化染色也得到相似的结论。这就证明了在骨关节炎起初阶段，由于软骨下骨发生病变，导致会新生血管增大速度加快，提高破骨细胞的整体活动，骨软骨复合体当中形成一种极为特殊微管道，微血管经过特殊微管道主见进入到软骨层当中，导致潮线出现重叠情况[16-17]。软骨内血管的增生会提高软骨的损害，进而其还会释放出一些细胞因子，提高新生血管的产生，在晚期病变中，由于骨赘增生会控制血管生成因子的释放，致使血管增生逐渐降低。微血管侵入和软骨损坏的互相作用证明血管增生的水平可反映关节炎的严重程度[18]。

综上所述，本研究通过显微CT对大鼠膝关节骨软骨复合体的骨质量与血管增生进行定量测定，提示在骨关节炎不同时期，骨质量与血管增生呈时间依从性变化，具有相关性，为骨关节炎发病机制中血管增生理论提供了进一步的佐证，同样还为临床早期干扰骨关节炎的发展提供了全新的思路。

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