生长分化因子11在胰腺癌中的表达及临床意义

柳俨哲，邵丽娟，陈 况，王子政，王 瑨，樊克兴，胡明根

解放军总医院，北京 100853 1肝胆外二科；2肿瘤内科

胰腺癌是消化系统中最常见的实体肿瘤之一，其恶性程度高、预后差，整体5年存活率小于8%[1]。中国癌症中心数据显示，胰腺癌在我国恶性肿瘤中发病率位居第9位，死亡率位居第6位[2]。早期区域性淋巴结转移和晚期血行转移与胰腺癌较差的预后相关[3]。手术根治性切除是目前对于胰腺癌最有效的治疗手段，但由于其自身肿瘤生物学特性，发病早期缺乏易观察的症状，大多数患者在确诊时已属于晚期而失去手术机会。因此，探索胰腺癌的发生发展机制，寻找预后相关的基因分子对于胰腺癌的整体治疗效果具有重要的临床意义。生长分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)，也称为骨形态发生蛋白11(bone morphogenetic protein 11，BMP11)，是转化生长因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)和 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)亚家族中的一员[4]。最初研究发现GDF11可通过上游及下游组件调控多个发展过程影响肌肉生成，与肌肉生长抑制素(GDF8)共同调节肌肉生长[5-6]。近期的研究表明GDF11还具有抗衰老的功能，主要表现为逆转心肌衰老[7]、改善大脑血供与认知能力[8]、改善衰老骨骼肌功能[9]。BMP家族被认为是一系列可调控细胞增殖、凋亡及分化的分子[10-12]，与食管癌[13]、前列腺癌[14]、乳腺癌[15]等恶性肿瘤的生物学行为相关，但GDF11在胰腺癌中的相关研究尚缺乏。因此，本研究通过检测胰腺癌中GDF11的表达水平，并结合临床资料分析GDF11与胰腺癌临床病理的关系，探讨其在预测胰腺癌患者预后中的作用。

资料和方法

1 资料 收集解放军总医院肝胆外二科2016年12月- 2017年3月胰腺癌术后的28例患者及胰腺癌组织芯片(上海芯超生物科技有限公司)中63例患者的病例资料，包括年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤转移、神经浸润、T分期和N分期。资料中所有胰腺癌患者术前均未接受放化疗。28例胰腺癌患者的癌组织和癌旁组织标本(距胰腺癌病灶边缘2 ～ 5 cm)在采集后均进行新鲜冷冻组织的保存以及石蜡包埋组织的制作。其中新鲜组织立即置于液氮冷冻，并保存于-80℃冰箱中。组织芯片中的胰腺癌标本均有配对的癌组织和癌旁组织。本实验经解放军总医院伦理委员会批准，并得到每一位患者的知情同意。

2 总RNA提取和实时定量PCR检测GDF11 采用Ultrapure RNAKit试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，按试剂盒说明书提取胰腺癌患者冷冻组织总RNA。提取后置于NanoDrop 1000 Spectrophotometer进行RNA浓度的测定，A260/A280比值为 1.8 ～ 2.0。使用 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)逆转录合成cDNA。实时定量PCR按照Trans Start Top Green qPCR Super Mix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书在ABI7500实时定量PCR仪进行实验。GDF11引物序列为：上游5'-GATCTTGAGCAAA CTGCGGC-3'，下游5'-TGAAGTCGATGCTCTGCCA A-3'；内参PPIA的引物序列为：上游5'-TCATCTG CACTGCCAAGACTG-3，下游5'-CATGCCTTCTTTC ACTTTGCC-3'。每个样品均行3次重复，应用2-△△Ct法进行mRNA的相对定量。

3 免疫组化 将组织切片脱蜡后依次浸泡于二甲苯、梯度乙醇中进行水化，随后于高压锅内的枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，再将切片放入3% H2O2静置15 min灭活内源性过氧化氢酶，滴加山羊血清封闭液室温静置30 min进行封闭，滴加GDF11一抗(1∶500稀释的兔抗人抗体，美国ABcam公司)4℃下过夜，再加入二抗(即用型兔鼠通用二抗，上海基因科技公司)常温静置30 min，滴加DAB显色液后以苏木素衬染，最后以梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片保存。在每一步操作后均以ddH2O和PBS洗净残液。GDF11免疫组化的染色结果由2名病理科医师采用二级计分法进行定量分析。细胞着色程度：0分，无着色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，黄褐色。阳性细胞数量按照百分比计数(0 ～ 100%)。表达评分为细胞着色程度分与阳性细胞百分比的乘积(0 ～ 3分)，总分值大于1分定义为高表达。

4 研究指标 1)检测28对胰腺癌组织及配对癌旁组织中GDF11的mRNA水平；2)将91对(自取的28对与组织芯片的63对)胰腺癌及配对癌旁组织的蜡块标本进行免疫组化染色，以检测GDF11蛋白的表达情况；3)分析GDF11的表达与91例胰腺癌患者临床病理资料之间的关系。

5 统计学方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料以-x±s表示，采用配对t检验进行组间比较；计数资料以例数表示，采用χ2检验进行组间比较分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 GDF11在胰腺癌及配对癌旁组织中mRNA的表达 应用实时定量PCR方法对28对胰腺癌组织及配对癌旁组织的mRNA进行检测。如图1所示，癌旁组织GDF11 mRNA表达水平显著性高于肿瘤组织(P=0.003)。

2 GDF11在胰腺癌及配对癌旁组织中蛋白的表达应用免疫组化技术对91对胰腺癌组织及配对癌旁组织标本的蛋白进行检测(图2)。GDF11在癌中和癌旁中的高表达率分别为40.7%(37/91)和71.4%(65/91)，差异有统计学意义(χ2=17.486，P＜0.001)。见图 3。

3 GDF11的蛋白表达水平与临床病理指标的关系GDF11蛋白高表达的胰腺癌患者神经浸润较少(P=0.004)、T分期较低(P=0.003)、N分期较低(P=0.018)，性别(P=0.093)、年龄(P=0.648)、组织学分级(P=0.552)和远处转移与否(P=0.090)与GDF11的表达无关。见表1。

表1 GDF11的蛋白表达水平与临床病理指标的关系Tab. 1 Relationship between GDF11 expression and clinicopathologic parameters (n=91)

图 1 GDF11在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达(mRNA水平)Fig. 1 mRNA expressions of GDF11 in pancreatic cancer tissues and corresponding paracarcinoma tissues

图 3 GDF11在胰腺癌及癌旁组织中的蛋白表达情况(n=91)Fig. 3 GDF11 protein expressions in pancreatic cancer tissues and paired paracarcinoma tissues (n=91)

讨 论

胰腺癌是一种复杂的异源性疾病，其发病涉及多种基因的缺失、扩增以及变异[16]。它的恶性程度极高，5年整体生存率仅为5%。胰腺癌的已知危险因素包括吸烟、2型糖尿病、肥胖、饮酒以及慢性胰腺炎等[3]。在疾病的早期阶段，胰腺癌无明显特异性症状，这使得早期诊断及治疗十分困难。胰腺癌的发生发展过程涉及特定通路上一系列基因的改变，然而目前缺乏有效的预后相关分子[3]。

早期研究发现，GDF11参与调控哺乳动物神经元的产生、肾结构的形成、胰腺的发育等[17-19]。与TGF-β超家族的其他成员一样，GDF11与膜表面的丝氨酸/苏氨酸受体结合后，参与下游基因的表达调控[20]。近年来，GDF11因“抗衰老”功能得到了广泛关注。2013年，Loffredo等[7]首先发现通过向高龄小鼠注射GDF11，衰老心肌出现了向年轻态的转变。GDF11同样被证实可以逆转年老小鼠骨骼肌的衰老[9]。2014年，Katsimpardi等[8]发现GDF11还能有效地改善高龄小鼠的神经认知功能。然而目前关于GDF11与肿瘤关系的研究尚缺乏。

图 2 GDF11在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达(蛋白水平)A：GDF11高表达于胰腺癌组织； B：GDF11低表达于胰腺癌组织； C：GDF11高表达于胰腺癌旁组织； D：GDF11高表达于胰腺癌旁组织(放大)Fig. 2 Protein expressions of GDF11 in pancreatic cancer tissues and paracarcinoma tissues A: High expression of GDF11 in pancreatic cancer tissues; B: Low expression of GDF11 in pancreatic cancer tissues; C: High expression of GDF11 in pancreatic paracarcinoma tissues; D: High expression of GDF11 in pancreatic paracarcinoma tissues (magnif i cation)

TGF-β超家族在癌症的发生发展中具有双重作用。TGF-β通路可促进晚期癌症细胞的增殖、侵袭和转移，而对于早期癌症细胞以及正常细胞该通路起着肿瘤抑制作用[21-23]。在结直肠癌中，GDF11的表达水平上调，并且高表达的GDF11还与淋巴结转移、较差的预后相关[24]。也有研究报道GDF11在三阴性乳腺癌中起着肿瘤抑制作用[25]。Zhang等[26]发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)可以激活GDF11的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。最近的研究证明，GDF11在肝癌中的mRNA和蛋白表达量是下调的，并且通过Smad2/3信号通路起到抑癌作用[27]。因此，GDF11作为TGF-β超家族中的一员也与肿瘤的发生发展密切相关。

本研究从mRNA以及蛋白水平上检测了胰腺癌组织及对应癌旁组织中GDF11的表达情况，结果表明GDF11在胰腺癌中的表达量是下调的，并且GDF11表达量越高，神经浸润的发生率(P=0.004)、T分期(P=0.003)和N分期(P=0.018)越低。尽管GDF11高表达组的远处转移率低于GDF11低表达组，但此差异并不显著，可能与样本量较少、手术适应证的选择相关。在过去的研究中，Wang等[28]发现与GDF11同家族的BMP2可以抑制肾癌细胞的增殖作用并诱导骨质骨形成。Bokobza等[29]发现GDF9因子通过使肿瘤细胞免受Caspase-3介导的细胞凋亡，促进前列腺癌细胞的生长增殖。GDF11在胰腺癌中表现肿瘤抑制作用，其有可能通过调控肿瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤细胞的增殖。本研究是一个回顾性研究，病例数有限，因此需要更大数量的样本量去验证，以及进一步的研究明确GDF11在胰腺癌发生发展中的分子机制。

综上所述，GDF11在胰腺癌中的表达是降低的，并且GDF11的高表达与胰腺癌患者较好的预后相关，其在胰腺癌的发生发展过程中可能起到抑癌基因的作用。因此GDF11可能成为胰腺癌的预后预测因子，关于GDF11在胰腺癌中的抑癌机制，我们将在后续的研究中进一步探讨。

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