菟丝子总提物对雷公藤多苷POF大鼠模型影响的探讨

★ 管雁丞 何中平 黄长盛 周汝云 黎德育（.深圳市中医院妇产科 广东 深圳58034；.深圳市南山区人民医院中医风湿科 广东 深圳 50000）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁前，卵巢储备功能衰退，以高促性腺激素、低雌激素水平为主要临床表现的妇科内分泌疾病。发病率为1%～3%［1］，约10%的育龄期女性不孕症由 POF 所导致［2］，严重危害了妇女的身心健康。随着自身免疫性疾病等发病率逐年增加，接受免疫抑制剂治疗的患者越来越多。临床研究证实，多种免疫抑制剂可引起POF，故本实验立足于雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠模型，采用减味寿胎丸（去阿胶）主药-菟丝子总提物进行干预，初步探讨减味寿胎丸的主要作用成分及其机制。具体如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠，重230～250g，周龄约8周，共44只，由广东省动物实验中心提供（动物合格证号：SYXK（粤）2014-0140）。饲养于深圳大学SPF级动物房。

1.2 实验药品 雷公藤多苷悬浮液：将雷公藤多苷片（黄石飞云制药有限公司，产品批号：20151203，国药准字：Z42021212）配置成浓度为15mg/mL的悬浮液。

补佳乐水溶液：将戊酸雌二醇片（1mg/片，DELPHARM Lille S.A.S产，生产批号：278A，国药准字：J20130009。）配置成浓度为0.02mg/mL的悬浮液。

菟丝子总提物：取干燥菟丝子药材（康美药业）1000g，总提物为醇提物与水提物所得浸膏合并所得。根据人鼠体表面积换算公式，折算系数为6.25，采用6倍等效剂量。大鼠日用量（g）=6×成人日用量（30g）/60kg×6.25/1000×提取率（0.18）×大鼠体重（g）。用生理盐水溶解菟丝子干浸膏，调整浓度为0.15g/mL。

1.3 实验方法 大鼠进入SPF级动物房适应性喂养1周后，连续10d每日取大鼠阴道脱落细胞涂片观察动情周期，选取有正常动情周期大鼠共44只纳入实验，随机分为4组：对照组、模型组、补佳乐组、菟丝子总提物组（简称TSZ组），每组各11只。对照组予等剂量纯净水，余下各组给予雷公藤多苷混悬液75mg/（kg·d）灌胃，日1次，连续30d。30d后，空白对照组、模型组继续予等量纯净水灌胃；补佳乐组以补佳乐水溶液灌胃，给药量0.1mg/kg/d；TSZ组：予菟丝子总提物水溶液灌胃，给药量（g）=3.375×大鼠体重（g），日1次，连续30d。

1.4 观察指标

1.4.1 动情周期的观察 每日上午九时开始进行阴道涂片观察动情周期变化。具体步骤：将生理盐水蘸湿的无菌棉签轻轻插入大鼠阴道内，轻柔旋转一圈后取出，迅速将分泌物涂布于玻片，然后置于10×10倍光学显微镜下观察。正常大鼠动情周期为4～5d，且按动情前期、动情期、动情后期、动情间期变化，周而复始，具有规律性。动情周期各阶段判定标准依据参考文献［3］，具体见表1。

表1 动情周期各阶段判定标准

1.4.2 血清激素及细胞因子水平检测 给药结束后1～5d内选择非动情期大鼠，腹主动脉取血、处死，离心取血清后，采用ELISA法检测血清E2、FSH、LH、AMH水平。

1.4.3 卵泡计数及卵巢组织形态学观察 取出同侧卵巢后，快速置于4%多聚甲醛中固定24h，常规石蜡包埋，从最大剖面以4μm厚度连续切片6张，HE染色，在光学显微镜下（10×10倍）观察卵巢组织形态改变，根据卵泡结构及大小对卵泡分级，分级标准依据参考文献［4］，计数最大剖面的生长卵泡、黄体及闭锁卵泡。（深圳市第六人民医院病理科协助）

2 统计学处理

3 实验结果

3.1 大鼠动情周期的观察 为方便统计研究，以两个动情周期即10d，作为观察点，即以D1-D10、D11-D20、D21-D30动情周期变化来对比研究。实验发现造模约10d开始，部分大鼠动情周期逐渐紊乱，无规律性，或者部分大鼠动情周期延长至6～9d。造模第30d，大鼠均动情周期紊乱或延长（造模期间，有2只大鼠因操作失误死亡）。干预期间，TSZ组动情周期基本恢复规律，与补佳乐组相仿，具体见表2。

表2 大鼠动情周期的变化 只

3.2 大鼠血清激素水平及细胞因子的比较 与对照组比较，模型组E2水平明显降低，FSH、LH、AMH水平明显升高（P＜0.01）；与模型组，两治疗组E2水平升高，FSH、LH、AMH升高（P＜0.01或0.05）；与对照组比较，两治疗组无显著性差异，两治疗组组间比较无显著性差异（P＞0.05），见表3。

表3 血清激素水平及细胞因子的比较

3.3 大鼠卵泡计数的比较 与对照组比较，模型组生长卵泡及黄体数量明显减少，闭锁卵泡明显增多（P＜0.01）；与模型组比较，两治疗组生长卵泡及黄体增多（P＜0.01或 0.05），闭锁卵泡减少（P＜0.05）；与对照组比较，两治疗组无显著性差异，两治疗组组间比较无显著性差异（P＞0.05），见表4。

表4 大鼠卵泡计数的比较 个

3.4 卵巢病理切片 对照组镜下可见卵巢血运丰富，各级卵泡生长活跃，黄体发育良好。模型组肉眼可见大鼠卵巢萎缩苍白，部分卵巢组织纤维化明显。镜下见生长卵泡明显减少，成熟卵泡基本未见，闭锁卵泡明显增多，部分可见空囊泡，黄体数量少，间质可见纤维组织增生。治疗组大鼠卵巢镜下各级卵泡较模型组明显增多，可见成熟卵泡，黄体数量增加，可见少量闭锁卵泡，间质未见明显纤维组织增生。见下图1-4（HE染色，10×10）。

图1 正常组

图2 模型组

图3 补佳乐组

图4 TSZ组

4 讨论

雷公藤类药物为临床常用抗免疫风湿类药物，临床有研究认为生殖系统损伤的发生与其日用量关系密切［5］。另亦与它的累积剂量有明显关系。雷公藤多苷累积剂量＞8000mg时，闭经发生率为95%［6］。亦有报道，雷公藤的自身免疫治疗剂量明显高于其有效抗生育阈剂量［7］，表明雷公藤在发挥免疫抑制作用的同时，不可避免地影响到生殖功能。

近年来，雷公藤致卵巢早衰模型的研究颇多。用药剂量10mg/kg至75mg/kg不等，大多研究集中于40mg/kg至75mg/kg。大鼠的动情周期为4～5d，文献研究报道，用药时间为10d至10周不等。高慧等［8］以雌性大鼠为研究载体，分别用雷公藤5mg/（kg·28d）、10mg/（kg·28d）、20mg/（kg·28d）、50mg/（kg·14d）、50mg/（kg·28d）、75mg/（kg·14d）、75mg/（kg·28d） 、100mg/（kg·14d）、100mg/（kg·28d）进行对比研究，结果发现，以50mg/（kg·14d）成模最理想，75mg/（kg·14d）模者次之，75mg/（kg·28d）较75mg/（kg·15d）卵巢功能损伤程度重；吴克明等［9］以雌性小鼠为研究载体，通过研究发现40mg/kg·10w为最佳造模剂量，同时观察到停药4周，小鼠卵巢功能即可恢复。

笔者通过大量前期研究，并重复实验研究比对了3月龄、6月龄及11～12月龄三个不同月龄段大鼠卵巢功能损伤程度，发现75mg/（kg·30d）的造模方法可更稳定、可靠地致卵巢储备功能下降［10］；3月龄及6月龄大鼠卵巢功能损伤程度大致相仿，且有进一步加重的趋势，而11～12月龄初老大鼠在生理上接近卵巢功能衰退期，造模后，卵巢储备功能明显下降。故本实验选用75mg/（kg·30d），性活跃期大鼠的造模方法重复实验。

根据临床症状，该病应属于祖国医学“闭经”“年未老经水断”“不孕”等范畴。中医认为此类药物应属于邪毒，直接损伤胞宫，导致冲任失调或直接损伤冲任二脉，通过生殖轴影响肾与天癸；雷公藤致卵巢早衰的主要病因为肾阴阳两虚，治疗应以补肾为主，且平调肾阴肾阳最佳。据近年来文献报道，药源性卵巢早衰的临床观察及实验研究均使用补肾法，常选用左归丸、右归丸、归肾丸等补肾名方，均有显效。此类方剂药味较多，不便于临床新药开发。

本课题组前期研究中，采用药少而力专的减味寿胎丸进行研究，实验表明，减味寿胎丸能成功拮抗、修复雷公藤诱导的卵巢损伤。菟丝子是该方君药，性味甘平，平补肾阴肾阳，益精养血。近年研究发现，菟丝子主要有效成分菟丝子黄酮具有类雌激素活性，一方面能调控凋亡相关基因，抑制颗粒细胞凋亡；一方面能调控颗粒细胞分泌性激素和细胞因子的能力，以延缓卵泡闭锁［11］。槲皮素属于菟丝子黄酮主要药用成分之一，实验证明其具有类雌激素作用，可以抑制生殖细胞凋亡，促进卵泡发育［12］。故本研究运用菟丝子单味药进行药源性卵巢早衰大鼠的干预性研究，以期初步探讨减味寿胎丸的主要药物成分及其作用机制，以指导临床用药。

本研究发现，造模第30d大鼠基本出现动情周期紊乱、延长，造模成功；干预实验中，菟丝子总提物能显著提高血清E2，降低血清FSH及LH；能显著升高AMH；能增加生长卵泡数量，延缓或减少卵泡闭锁，减轻大鼠卵巢间质纤维样改变，改善大鼠卵巢损伤，避免卵巢萎缩，增加卵巢指数。

由此可见，菟丝子总提物可能具有类激素样作用，直接提高了卵巢对促性腺激素的反应性，使E2升高，FSH、FSH/LH降低，从而改善卵巢功能；AMH明显升高，亦说明卵巢储备能力提高；并延缓了POF的病理进程。

5 结论

菟丝子作为减味寿胎丸主药，其总提物可显著提高卵巢储备能力，修复卵巢组织损伤，可指导临床用药，并为新药开发指明方向。

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