微囊藻毒素化学分析方法研究进展

刘 群

1 微囊藻毒素结构及性质

微囊藻毒素(Microcystins，简写为MCs)，是带有特征的共轭二烯芳香族氨基酸支链的一类环状七肽化合物，主要由淡水藻类铜锈微囊藻(Microcystisaeruginosa)产生，其他很多种类的微囊藻也可以产生，如颤藻属(Oscillatoria)、鱼腥藻属(Anabaena)等[1]。

MCs的结构如图1 所示，其中X，Z为两种可变的L-氨基酸。由于X和Z的不同，藻毒素有100多种异构体，其中存在最普遍、含量相对较多且毒性较大的是MC-LR、MC-RR和MC-YR[2](L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸)。有毒性的蓝藻主要有以下几种，微囊藻(microcystis)、 鱼腥藻(Anabaena)、浮丝藻(Plankthotrix)等，产生微囊藻毒素、拟柱胞藻毒素等众多毒素[3]，MC-LR是MCs中最为常见、已知毒性最强、危害最大的一种，其半致死剂量(LD50)仅为50μg/kg[4]。

图1 微囊藻毒素的结构

由图1可见，虽然微囊藻毒素的结构相似，但理化性质却不同。微囊藻毒素含苯环、共轭双键等结构，化学性质相对稳定，一般条件下无法去除，而侧链含羧基、氨基和酰胺基，在不同的pH 条件下，会有不同的离子化倾向。由于微囊藻毒素的正辛醇-水分配系数较小，在爆发蓝藻期间MC-LR 的生物富集效应较小，微囊藻毒素在阳光照射下依然能保持稳定，但暴露于紫外线时即可被水解或失活，一般条件下，当紫外线波长接近其吸收峰周围( 即238～254 nm) 时，微囊藻毒素可被迅速降解[5]。目前我国许多湖泊、水库等大中型水体都发现含有微囊藻毒素[6]，这些被污染的水体大多还作为饮用水源，对饮水人群构成了潜在的健康危害。流行病理学调查研究表明，人体如果长期摄入微囊藻毒素，将具有潜在的致癌可能[7]。微囊藻毒素是以动物肝脏为作用靶器官的一类肝毒素，并且能够特异性地抑制蛋白磷酸酶活性从而诱发癌症等一系列病变，是世界各国广泛存在同时危害很大的一种蓝藻毒素。分析报告还显示，MCs 与肠、胃等其他消化道器官肿瘤也有着千丝万缕的关系[8]。鉴于MCs的极大危害，国际卫生组织(WHO)建议将饮用水中的MC-LR控制为1.0 μg/L[9]，我国新生活饮用水卫生标准( GB 5749-2006) 的饮用水中MC-LR 限值也为1.0 μg/L。目前，富营养化是我国湖库面临的共性问题，藻类水华造成的藻毒素污染严重威胁到湖库型饮用水源地的供水安全。因此，综合研究国内外微囊藻毒素的分析方法，对人类的生存环境有着十分重要的意义，本文着重综合微囊藻毒素的化学分析方法的研究进展。

2 微囊藻毒素的分析方法

2.1 微囊藻毒素的一般检测方法

表1 微囊藻毒素的检测方法

由表1可见，目前，国内外关于微囊藻毒素的检测方法主要为三大类，此外，化学检测方法还有毛细管电泳等检测方法，可以对其进行定量分析。下面将结合目前的分析手段，进行综合评述化学检测方法在微囊藻毒素中的应用和发展。

2.2 化学分析方法综合研究进展

目前薄层层析色谱(TLC)、化学分析方法主要有高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MC)、气相-质谱联用(GC-MC)、毛细管电泳(CE)等方法，萃取-液相色谱、硅藻土吸附微囊藻毒素等方法在进一步的研究发展中，几种分析方法的优势劣势分析如表2所示。

表2

2.2.1 高效液相色谱分析法 在化学分析方法中，HPLC是应用最为广泛的一种[10]，是利用微囊藻毒素的理化性质，对其进行定性分析和定量分析。因HPLC重现性好、准确度高和灵敏度高等优点，能对不同的MCs同分异构体分析，研究集中在前处理(对样品)、色谱分析条件、淋洗液、洗脱液、SPE柱等。

如今，对微囊藻毒素的化学分析方法基本以Harada方法[11]为参考依据，沈强等人[12]提出微囊藻毒素的HPLC快速检测方法，建立了一种快速检测微囊藻毒素的检测体系，MC-RR，MC-LR的保留时间大大缩短，在0.4-100 ug/mL的浓度范围内线性关系良好。

龚黎明[13]利用梯度洗脱技术,根据流动相(甲醇和水)的不同配比，添加三氟乙酸(TFA)，优化高效液相色谱法去检查分析环境样品中的微囊藻毒素的含量，通过实验表明，高效液相色谱法梯度洗脱法分析MCs，时间短、灵敏度高，线性定量范围在0.1～5 mg/L。

高效液相法分析微囊藻毒素需要大型贵重仪器设备，检测过程比较耗时，分析时需MC标准物质，只能以MC-LR为参考物质，由于各个实验室的检测流程和分析条件的差异，对分析结果有一定的偏差和影响，这也是HPLC分析MCS的缺点之一。

2.2.2 高效液相色谱-质谱联用分析法 液质联用(HPLC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，综合了液相色谱的分离系统和质谱的检测系统，在环境样品分析、食品分析和药物分析方面得到广泛的应用。此法用于分析微囊藻毒素，可以有效的对含有多种藻毒素的样品进行有效分离和检测，因此在环境水质检测时可以使用。

由于只有少数的藻毒素有与之相对应的标准品，如被检测的标准品为已知，可通过检测物的结构信息对其进行定性分析，再对藻毒素定量分析时确保达到更高的精确度。

杨立新等[14]采用液质联用技术(UPLC-MS/MS)，建立了水样过0.22 μm滤膜，直接进样测定自来水、地下水及地表水中8种有机污染物(草甘膦、呋喃丹、灭草松、莠去津、2,4-滴、丙烯酰胺、微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR)的分析方法。此法的优点是简便快捷、检测灵敏度高，无需提纯处理，直接进入仪器分析，但是缺少各种微囊藻毒素的标准物质，实验成本较高。

2.2.3 气相色谱-质谱联用分析法 气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术用于MCs的测定，检出限在达ng /L。Tsuji[15]等发明了2-甲基-3-甲基氨-4-氨基铬酸检测方法，用NaIO3与KMnO4对提取后样品进行氧化的原理。利用GC测定2-甲基-3-甲基氨-4-氨基铬酸的含量，即可间接分析微囊藻毒素的总量。此法的优点是可以准确、快速的对痕量微囊藻毒素进行定量分析，劣势为仪器设备昂贵，一般实验室无法采用，因此无法普及。同时技术含金量较高，操作较复杂，无专业技术背景的研究人员无法进行操作，另外在缺少标准品的情况下，不能对微囊藻毒素定性分析，前处理过程复杂，综合以上劣势，会导致实验结果和分析有差别。需要注意的是，藻毒素本身含有毒性，在进行分析的时候，应该尽量避免MCs气化进入空气中对人体造成伤害。

2.2.4 其他化学检测方法 毛细管电泳法和薄层色谱法都是检测微囊藻毒素的方法，前者是用毛细管区带电泳、胶束电动毛细管与紫外、荧光等串联分析微囊藻毒素的分析，具有自动进样、待检测样品量多优点，同时具有柱上富集的功能。但由于重视差，目前毛细管电泳法还暂时不能作为水体检测MCs的常规手段。

薄层色谱法，是利用MCs及其衍生物与有色或荧光物质发生反应的一种分析手段，该法优点是具有较高灵敏度及分辨率，快速分离，操作简便，预处理简单。但是其无法达到最高检出限，定量准确性有待提高。

此外，还有固相萃取-液相色谱也在测定环境水样中痕量的MCs，目前，有用磁性膨胀土作为吸附剂研究环境样品的MCs的含量，力求建立一种稳定性好、绿色环保的环境水样痕量分析方法，连丽丽等人[16]提出用CoFe2O4磁性纳米材料，用于取出水中的微囊藻毒素，通过优化洗脱条件，结合高效液相色，建立微囊藻毒素的有效检测手段，此法在进一步研究之中。

3 结 论

随着经济的快速发展，环境问题越来越凸显出来。水体富营养化的加剧，淡水湖泊水华现象的反复出现，微囊藻毒素在蓝藻水华时，由于其特殊毒性，以及其对人有致癌和潜在危害，因此掌握微囊藻毒素的检测方法十分必要，以便及时监控水中微囊藻毒素的含量。近年来，微囊藻毒素的检测技术逐渐增多，分析手段也越来越多，不同的分析方法有自身不同的优缺点，结合检测目的，选择合适的适宜方法。本文主要对微囊藻毒素的化学检测方法进行综合评述，旨在给相关科研工作者相关理论，对分析者有所帮助，同时能对水体富营养化进行实时监测，并作出相应的风险分析，共同致力于保障大众的饮用水安全，不受微囊藻毒素的危害。以人为本，确保饮用水安全是水污染治理与环境保护的首要任务。湖库富营养化和藻类水华的产生与发展是一个长期渐进演化的过程，其治理也非一日之功。但我们日常的生产生活时刻离不开水，有效解决藻毒素污染饮用水源就具有紧迫的现实意义。

参考文献：

[1] Neilan Ba, Pearson La, Muenchhoff J, et al. Environmental conditons that influence toxin biosynthesis in cyanobacterial [J]. Envioronmental Microbiology, 2013, 15(5):1239-1253.

[2] Carmichael W. W. , Eschedor J. T. , Patterson G. M. I. , et al. Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (Blue-green Algae)[J].Toxicon.2012, 26 (11):971.

[3] Wiegand C, Pflugmacher S. Ecotoxicological effects of selected cyanobacterial secondary metabolites: a short review [J]. Toxicol Appl Pharmacol. 2005, 203:201-218.

[4] Wang Jinli, Liang Wenyan, Ma Yanyan, et al .The influence factors of microeystin-LR degradation through electrochemical oxidation processes using Ti/RuO2anodes [J].China Environmental Science,2013,28 (8):709.

[5] Yang C-Y,Liu S-J,Zhou S-W,et al.Advance in study on the ecotoxicological effect of microcystins against microorganisms． Asian Journal of Ecotoxicology,2009,4( 13) : 602-608 ( in Chinese).

[6] 董传辉,俞顺章,陈刚，等.某湖周围水厂源水及出厂水微囊藻毒素调[J] .卫生研究, 1998, 27(2):100-102.

[7] Humpage A R, Falconer I R.Microcy stin-LR and liver tumor promotion:effets on cy to kinesis, ploidy , and apoptosis in cultured hepatocy tes [J] .Env ironmental Toxicology, 1999, 14(1):61- 75.

[8] 周伦,陈坤,余海.饮用水源中微囊藻毒素与大肠癌发病的关系[J] .中华预防医学杂志, 2000, 34(4):224-28.

[9] WHO guidelines for drinking-water quality, addendum to volume 2[ EB/OL] . http ://w ww .who .int/ docstore/ water- sanitation- health/GDWQ/ Summary - tables/Sumtab .html.1998/ 2004-01-02 .

[10] 崔萌萌,马康，何雅娟，等. 微囊藻毒素检测方法研究进展[J]. 化学分析计量, 2012,21(6):95-96.

[11] Fastner J, Flieger I, Neumann U. Optimised extraction of mi-crocystins from field samples -a comparison of different different sol-vents and procedures [J]. Water Research, 1988，32(10): 3177-3181.

[12] 沈强,李嗣新，胡俊. 微囊藻毒素HPLC快速检测方法研究[J]. 环境科学与技术, 2017,40(2)：103.

[13] 龚黎明.高效液相色谱法检测微囊藻毒素的条件优化及应用研究[J].资源信息与工程，2017,32(2)：178-179.

[14] 杨立新, 张剑波, 路阳，等. 超高效液相色谱- 串联质谱法直接进样测定水样中8 种有机污染物[J]. 岩矿测试, 2014 , 32(2)：275-281.

[15] Tsuji K, et al. EnvironSci Technol, 1994,28:173-177.

[16] 连丽丽,郭亭秀,吴玉清，等. 磁性固相萃取-液相色谱法测定环境水样中痕量的微囊藻毒素[J]. 分析化学研究报告, 2015，43(12): 1876-1881.