乳腺癌组织中CXCR4表达及临床意义

浦 春，秦明明，刘 夏，刘小岑，卢林明，冯 钢

(皖南医学院 弋矶山医院，安徽 芜湖,241001)

乳腺癌是严重威胁女性生命和健康的最常见恶性肿瘤，美国最新统计表明，乳腺肿瘤排在女性新发病肿瘤的首位，而由乳腺肿瘤导致的死亡率仅次于肺和支气管等呼吸系统肿瘤[1]。研究证实，乳腺癌是少数早期发现并及时治疗能获得良好临床预后的恶性肿瘤[2]。然而，目前临床上尚缺乏能够准确诊断乳腺癌并有效评估乳腺癌患者预后的指标。血清肿瘤标志物的检测对于乳腺癌患者的筛查具有重要的临床意义，但其敏感性和特异性较低[3]，不能用于乳腺癌的早期诊断。趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)是G蛋白偶联的跨膜受体，在乳腺癌[4]等多种人类肿瘤中异常表达,其高表达预示患者有高转移率和较差的预后[5]。然而关于CXCR4 mRNA水平与乳腺癌临床病理指征的相关性国内外尚未见报道。本研究主要通过比较乳腺癌及邻近癌旁组织中CXCR4 mRNA的表达水平和乳腺癌及乳腺腺病组织中的CXCR4蛋白的表达情况，探讨CXCR4在乳腺组织中的表达情况和临床意义，并初步探讨CXCR4与乳腺癌患者临床病理指征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2016年1月～2017年5月在皖南医学院弋矶山医院甲乳外科就诊，临床诊断并经病理确诊的原发性乳腺癌患者48例、原发性乳腺腺病患者40例。收集48例乳腺癌患者术后的新鲜乳腺癌组织及邻近癌旁正常组织，所有新鲜组织样本立即放入液氮中保存;收集48例乳腺癌患者和40例乳腺腺病患者的石蜡包埋组织标本。40例乳腺腺病患者的平均年龄(48.22±8.47)岁；48例乳腺癌患者平均年龄(54.38±10.28)岁。所有患者均经术后的病理检查确诊，且手术之前未接受放疗、化疗或其他治疗。

1.2 仪器与试剂

组织中CXCR4蛋白检测使用的Anti-CXCR4抗体(ab13854)来自abcam公司。其他试剂和材料主要有二甲苯、梯度乙醇(100%、90%、80%、70%)、3%过氧化氢(甲醇配制)、1%盐酸酒精、苏木精染液等。CXCR4蛋白检测使用的免疫显色剂是BondTMPolymer Refine Detection，来自徕卡显微系统(上海)公司，仪器是Leica Bond染色机，采用的是BOND MAX法。组织中总RNA的提取使用的试剂来自Trizol Universal(天根，北京)。总RNA的逆转使用的试剂来自RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，上海)，检测的仪器是美国labnet PCR仪。PCR 检测使用的试剂来自SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，北京)，检测的仪器是ABI 7500 Sequence Detection System (Life Technologies，美国)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为检测CXCR4的内参。所有引物设计与合成由广州市锐博生物科技有限公司完成。CXCR4的引物序列：上游(F)：5’CACGCCACCAACAGTCAGAG3’；下游(R)：5’GCAAAGATGAAGTCGGGAATAG3’；序列长度为107bp；GAPDH的引物序列：上游(F)：5’CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG3’；下游(R)：5’GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG3’，序列长度为99bp。

1.3 方法和结果判断

石蜡组织中CXCR4蛋白检测使用的方法是免疫组织化学法。CXCR4的阳性信号主要定位于胞浆和(或)胞膜上。根据肿瘤细胞阳性反应百分率和染色程度进行综合评定和分析。阳性率计分标准：0分(0)，1分(1%～33%)，2分(34%～66%)，3分(67%～100%)；染色程度计分标准：0分(无阳性染色)，1分(浅黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色)。按2种得分的乘积分为4个等级：(-)0分，(+)1～2分，(++)3～4分，(+++)5～9分。CXCR4结果评判：(-)为阴性，(+)、(++)和(+++)为阳性。ER、PR、HER-2的结果判断参照ASO/CAP指南推荐的评分系统[6]：ER、PR阳性的乳腺癌细胞≥1%即为ER/PR阳性；HER-2的结果根据胞膜着色强度评定分为0、(+)、(++)、(+++)，>10%浸润癌细胞出现连续而完整的强胞膜着色阳性(+++)；着色强度(++)的患者为临界值，0和(+)为HER-2阴性。新鲜组织中CXCR4 mRNA检测的方法是实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，CXCR4 mRNA的相对表达水平用2-△△CT表示，以GAPDH为内参。

1.4 数据处理与统计学分析

2 结果

2.1 CXCR4 mRNA在乳腺癌组织中高表达

CXCR4 mRNA在乳腺癌旁正常组织相对表达量为(0.17±0.13)，而乳腺癌组织表达为(0.71±0.44)，差异有显著统计学意义(t=6.023，P<0.001)，乳腺癌组织表达水平明显高于正常组织(图1)。ROC曲线下面积为0.903(图2)。

图1 CXCR4 mRNA在乳腺癌组织中高表达Fig.1 Overexpression of CXCR4 mRNA in breast cancer tissues

图2 CXCR4 mRNA的ROC曲线Fig.2 The ROC curve of CXCR4 mRNA

2.2 CXCR4蛋白在乳腺癌及乳腺腺病组织中的表达

CXCR4蛋白在大多数乳腺腺病组织中不表达(-)或低表达(+)，而乳腺癌组织中以低表达(+)和高表达(++)为主(图3)。

图3 CXCR4蛋白在乳腺癌组织中高表达Fig.3 Overexpression of CXCR4 protein in breast cancer tissuesBOND MAX法：A.高表达；B.中度表达；C.低表达；D.不表达

CXCR4蛋白在乳腺癌及乳腺腺病组织中的阳性率分别为77.08%和20.0%，差异有显著统计学意义(P<0.001，表1)。检测CXCR4对乳腺癌的敏感性和特异性分别为77.08%和80.0%。ROC曲线下面积为0.791(图4)。

表1 CXCR4 在良恶性乳腺组织中的表达

Table 1 CXCR4 protein expression in benign and malignant mammary tissues

组别n-++++++阳性率/%x2值P值乳腺癌4811267477.08乳腺腺病403262020.0028.453<0.001

图4 CXCR4蛋白检测的ROC曲线Fig.4 The ROL curve of CXCR4 protein

2.3 CXCR4在乳腺癌中的表达与患者临床病理指征的相关性

表2 乳腺癌组织中CXCR4 mRNA水平与患者临床病理指征的相关性

Table 1 Correlation between CXCR4 mRNA levels and clinicopathological indications in breast cancer tissues

临床病理参数nCXCR4相对表达( x±s)F或t值P值年龄/岁≤50200.70±0.43>50280.71±0.460.0080.928组织学分级Ⅰ30.34±0.30Ⅱ330.67±0.42Ⅲ120.89±0.472.2830.114肿瘤直径/cm≤2190.68±0.40>2290.68±0.440.1000.753Ki-67增殖/%≤14120.48±0.27>14360.78±0.464.6710.036HER-2阴性200.65±0.43临界值170.87±0.50阳性110.55±0.302.0900.136PR阴性190.87±0.45阳性290.60±0.414.8520.033ER阴性131.04±0.43阳性350.58±0.3812.3360.001分子分型luminal A型80.51±0.33luminal B型280.60±0.39HER-2过表达型81.10±0.48ab基底细胞型41.00±0.36a4.6500.007

注：a表示相比于luminal A型，P<0.05；b表示相比于luminal B型，P<0.05。

3 讨论

乳腺癌是起源于乳腺导管、小叶的恶性肿瘤，已成为严重威胁女性生命与健康的疾病。随着分子生物学的研究进展，使临床“精准医学”的发展进入一个全新的时代。根据ER、PR、HER-2等相关指标可将乳腺癌分为4种分子分型：luminal A型、luminal B型、HER2过表达型和基底细胞型[7]。不同分型的乳腺癌有相应规范的治疗流程。趋化因子受体4(CXCR4)为趋化因子CXCL12(即基质细胞衍生因子-1α)的受体。研究表明CXCR4与CXCL12相互作用，在乳腺癌发生、进展和转移中起一定的作用[8]。

有研究指出，CXCR4在乳腺导管癌中既有高表达也有低表达，且CXCR4表达水平的高低在不同亚型导管癌中略有不同[9]。本研究结果表明，相比于癌旁正常乳腺组织，乳腺癌组织中的CXCR4 mRNA的表达水平明显升高。此结果与相关报道相一致[10]。另外，通过分析乳腺良、恶性组织中CXCR4蛋白表达结果，我们发现CXCR4蛋白在乳腺癌中的表达高于乳腺腺病，具有较高的敏感性(77.08%，P<0.001)，以上结果均提示乳腺组织中CXCR4的高表达对于乳腺癌的诊断和鉴别诊断具有一定的意义。

随着检验医学的发展，肿瘤标志物在临床得到了广泛应用。乳腺癌肿瘤标志物(ER、PR、HER-2)的检测不仅用于临床乳腺癌的诊断、分型，对于指导乳腺癌患者的治疗和预后也具有重要的临床意义[11-12]。通过分析乳腺癌组织中CXCR4的表达与患者临床病理指征相关性，我们发现乳腺癌组织中CXCR4的表达与ER、PR、Ki-67、分子分型密切相关，此结果提示CXCR4的表达与乳腺癌患者的疾病进展有关，对于指导乳腺癌患者的预后和治疗具有一定的价值。另外，乳腺癌组织中CXCR4的表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤的直径及组织学分级、HER-2指标无显著相关，与相关文献报道相一致[13]。然而，不同的判读医师、判读系统、抗体的选择、核分级等多种因素都会对免疫组化的检测结果造成影响[14]，同时组织中RNA水平的检测也容易受多种因素的影响以及受标本量的限制，因此，关于乳腺癌组织中CXCR4的表达与乳腺癌预后的相关性仍需后续进一步的研究。

本研究表明，CXCR4在乳腺癌组织中高表达，说明CXCR4对于乳腺癌的诊断具有较高的敏感性，且乳腺癌组织中CXCR4基因的表达与乳腺癌患者的ER、PR、分子分型等指征密切相关。患者乳腺组织中CXCR4高表达，提示该患者是乳腺恶性肿瘤的可能性较大，因此，乳腺组织中CXCR4的检测有望成为临床乳腺癌的诊断和预后判断的一个新的肿瘤标志物。

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