N6-甲基腺嘌呤与羟基自由基反应机理的研究

(上饶师范学院 化学与环境科学学院，江西 上饶 334001)

在生物体中，细胞DNA和RNA包含了复杂的遗传基因信息。为了保证正确的信息传递，生物体需保持DNA及RNA结构完整。然而，外界环境以及正常的代谢过程都有可能导致DNA、RNA损伤[1]。当这种损伤积累到一定的程度时，损伤将不能被修复，从而导致细胞癌变、衰老和死亡，最终表现为癌症、老化和神经症状[2]。

羟基自由基·OH是非常活泼的氧化剂，反应活性极强，因而在化学、医药、生物学等领域备受关注。·OH是活性氧自由基中的一种。活性氧自由基在生物体内会导致DNA、RNA、脂肪和蛋白质的氧化损伤[3-5]。其中·OH是公认的危害最大、反应活性最强的活性氧自由基，会导致许多疾病，例如关节炎、癌症、帕金森综合征[3]。在细胞组成当中，DNA及RNA对·OH的氧化是最敏感的。DNA和RNA都由三部分组成，分别是磷酸、戊糖和碱基，其中最容易被·OH氧化损伤的是碱基。DNA和RNA中除常见五种碱基(腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、胞嘧啶C)外，还存在一些稀有碱基，N6-甲基腺嘌呤(m6A)为其中的一种。m6A是A碱基的N(6)位H被CH3修饰的产物，是一种真核mRNA常见的内部修饰，会参与到很多转录后调控过程中，与多种生理功能有关[6]。显然，·OH导致m6A损伤将影响RNA转录过程及m6A的生理功能。据我们所知，文献中还未有·OH导致m6A损伤反应机理的理论研究报道。因此在本文中，我们期望了解·OH导致m6A损伤的机理。此外，在前一个工作中，我们研究了腺嘌呤A与·OH反应的机理，发现腺嘌呤A与·OH最可能发生的反应是·OH夺取A碱基的N(6)H，其次是·OH与A碱基发生C(8)位加成[7]。研究m6A与·OH反应机理亦能明确N(6)位甲基取代对A碱基与·OH反应的影响。

1 理论计算方法

运用HF泛函、M062X泛函以及B3LYP 泛函分别在6-31+G(d)水平上优化了m6A与·OH发生夺氢反应、加成反应所涉及的反应物、中间体、过渡态及产物的构型以及能量。此外，所有反应路径涉及的构型以及能量也在B3LYP 泛函6-311++G(d,p)水平上进行了优化。计算体系共涉及20个原子，其中有6个为重原子，考虑到计算效率，B3LYP泛函、6-311++G(d,p)基组能够提供准确的计算结果。计算所得的构型通过频率分析进行了确认。通过频率分析：所有的驻点具有的频率都为正值，而过渡态有唯一的虚频。此外，所有的过渡态运用内禀反应坐标进行了确认[8]。为了考察溶剂对反应过程的影响，通过连续介质模型(PCM)[9]对计算所得的能量进行了校正。所有计算都是通过Gaussian 09程序包[10]完成的。

2 结果与讨论

m6A的结构如图1所示，有2种异构体。I构型更稳定，在B3LYP/6-311++G(d,p)水平上I构型比II构型能量低7.4 kJ/mol。从这2种异构体出发，分别计算其与·OH发生夺氢反应和加成反应的路径，得到了类似的结果。因此本文只给出I构型的计算结果。

图1 N6-甲基腺嘌呤的结构

m6A与·OH发生夺氢反应和加成反应涉及的所有反应物、中间体、过渡态及产物的构型如图2-图7所示。在6-31+G(d)水平上，HF泛函，M062X泛函以及B3LYP泛函给出了相似的构型，但是能量稍有差别。例如，表1列出了在不同泛函/基组水平上计算的A路径——C(4)加成和H路径——夺取C(2)氢的反应能量。相对来说，HF泛函得到的能量明显偏大，而M062X泛函和B3LYP泛函提供了可信的结果。由于B3LYP泛函和M062X泛函计算所得的能量相似，可以认为B3LYP泛函能提供准确的计算结果。为了提高所得能量的精确性，所有反应路径涉及的构型以及能量用了精度较高的方法——B3LYP/6-311++G(d,p)进行计算。本文中所讨论的构型以及能量也都来自于B3LYP/6-311++G(d,p)方法计算所得的结果。

表1 计算所得N6-甲基腺嘌呤与·OH反应的能量 kJ/mol

2.1 N6-甲基腺嘌呤与·OH加成反应

·OH可以加成到m6A的C(4)位以及C(8)位，即发生如图2所示的C(4)加成以及C(8)加成反应。反应涉及的所有反应物、中间体、过渡态及产物的构型如图3所示。发生C(4)加成时，m6A首先与·OH复合，能量下降11.6(RA)kJ/mol。随后·OH加成到m6A的C(4)位，生成C(4)加成的产物PA，能量进一步降低。在B3LYP/6-311++G(d,p)水平上，产物PA的能量比反应物的低38.2 kJ/mol。C(4)加成是经由过渡态TSA完成，跨越此过渡态需要的能量(ΔE)为24.2 kJ/mol。发生C(8)加成时，我们没有优化出过渡态TSB的构型。通过扫描反应坐标，发现从反应物RB到产物PB能量一直降低，说明·OH加成到m6A的C(8)位是无势垒过程。产物PB非常稳定，其能量比反应物的低121.2 kJ/mol。

图2 N6-甲基腺嘌呤与·OH发生加成反应的机理示意图

图3 B3LYP/6-311++G (d,p)方法计算所得m6A与·OH发生C(4)加成反应及C(8)加成反应的相对势能曲线。PCM模型校正的能量列在括号里

2.2 N6-甲基腺嘌呤与·OH夺氢反应

m6A上共有7个氢原子，其中N(6)位、C(8)位、N(9)位、C(2)位各有1个氢原子，N(6)甲基上有3个氢原子(如图4所示)。从m6A与·OH构型出发，优化出6条夺氢反应路径(如图4所示)，涉及的所有反应物、中间体、过渡态及产物的构型如图5-7所示。在所有路径中，·OH与m6A发生夺氢反应的过程类似：m6A首先与·OH复合，形成的复合物经由一个夺氢过渡态生成最终的脱氢产物m6A(-H)·，并释放出一个H2O分子。

在B3LYP/6-311++G (d,p)水平上计算得到的·OH夺取m6A上N(6)H及N(6)甲基H的相对势能曲线如图5所示。由图5可知，在两条路径中m6A与·OH的复合都导致能量下降，能量分别下降19.1(RC)和23.6(RD)kJ/mol。经由过渡态生成产物后，能量进一步下降，最终产物(PC及PD)的能量相对于反应物的低101.0和126.2 kJ/mol。夺氢过程分别经由过渡态TSC及TSD完成，跨越过渡态需要的能量(ΔE)计算为1.9和2.9 kJ/mol。

图4 N6-甲基腺嘌呤与·OH发生夺氢反应的机理示意图

图5 B3LYP/6-311++G (d,p)方法计算所得·OH夺取m6A上N(6)H及N(6)甲基H的相对势能曲线。PCM模型校正的能量列在括号里

在B3LYP/6-311++G (d,p)水平上计算得到·OH夺取m6A上C(8)H及N(9)H的相对势能曲线如图6所示。由图6可知，在两条路径中m6A与·OH的复合也都导致能量下降，能量都下降26.3 kJ/mol(RE及RF)。经由过渡态生成产物后，能量进一步下降，最终产物(PE及PF)的能量相对于反应物的低39.3和104.2 kJ/mol。夺氢过程分别经由过渡态TSE及TSF完成，跨越过渡态需要的能量(ΔE)计算为36.8和3.0 kJ/mol。

在B3LYP/6-311++G (d,p)水平上计算得到·OH夺取m6A上C(2)H存在两条不同的路径，两条路径的相对势能曲线如图7所示。由图7可知，在两条路径中m6A与·OH的复合都导致能量下降，能量分别下降23.6(RG)和26.3(RH)kJ/mol。经由过渡态生成产物后，能量进一步下降，最终产物(PG及PH)的能量相对于反应物的低56.3和72.9 kJ/mol。夺氢过程分别经由过渡态TSG及TSH完成，跨越过渡态需要的能量(ΔE)计算为19.9和21.8 kJ/mol。

图6 B3LYP/6-311++G (d,p)方法计算所得·OH夺取m6A上C(8)H及N(9)H的相对势能曲线。PCM模型校正的能量列在括号里

图7 B3LYP/6-311++G (d,p)方法计算所得·OH夺取m6A上C(2)H的相对势能曲线。PCM模型校正的能量列在括号里

综合以上结果，m6A与·OH发生夺氢或加成反应所得产物的能量比反应物的都低，说明所有反应都放热，计算出的夺氢及加成反应都可能发生。从产物稳定性的角度考虑，夺取N(6)甲基H的产物(-126.2 kJ/mol)最稳定，其次是C(8)加成的产物(-121.2 kJ/mol)，随后是夺取N(9)H的产物(-104.2 kJ/mol)及夺取N(6)H的产物(-101.0 kJ/mol)。众所周知，反应的能垒决定了反应究竟能否发生以及反应的速率。从反应能垒的角度考虑，·OH加成到m6A的C(8)位(无势垒)能垒最低，其次是·OH夺取m6A上的N(6)H(1.9 kJ/mol)、N(6)甲基H(2.9 kJ/mol)、N(9)H(3.0 kJ/mol)。因此，m6A与·OH最可能发生的反应是·OH加成到m6A的C(8)位，其次是·OH夺取m6A的N(6)H、N(6)甲基H及N(9)H。

与腺嘌呤A的反应相比较，·OH与m6A反应各路径的能垒都降低了，且生成的产物更稳定[7]，说明CH3取代使腺嘌呤A更容易被·OH氧化。另外，腺嘌呤A与·OH最可能发生的反应是·OH夺取A碱基的N(6)H，其次是·OH与A碱基发生C(8)位加成[7]。而m6A与·OH最可能发生的反应是·OH加成到m6A的C(8)位，其次是·OH夺取m6A的N(6)H、N(6)甲基H及N(9)H。这说明CH3取代极大的影响了腺嘌呤A与·OH的反应机理。

3 结论

运用量子化学理论计算方法，计算了·OH夺取m6A上N(6)H、N(6)甲基H、C(8)H、N(9)H、C(2)H以及·OH加成到m6A的C(4)位、C(8)位的反应路径。反应涉及的所有反应物、中间体、过渡态及产物的构型以及能量利用HF泛函、 M062X泛函、B3LYP泛函分别在6-31+G(d)水平上，以及B3LYP泛函在6-311++G(d,p)水平上进行了优化。计算结果表明所有反应都为放热反应，都可能发生。根据产物的能量，夺取N(6)甲基H的产物(-126.2 kJ/mol)最稳定，其次是C(8)加成的产物(-121.2 kJ/mol)，随后是夺取N(9)H的产物(-104.2 kJ/mol)及夺取N(6)H的产物(-101.0 kJ/mol)。根据反应的能垒，·OH加成到m6A的C(8)位(无势垒)能垒最低，最容易发生；其次是·OH夺取m6A上的N(6)H(1.9 kJ/mol)、N(6)甲基H(2.9 kJ/mol)、N(9)H(3.0 kJ/mol)。因此，m6A与·OH最可能发生的反应是·OH加成到m6A的C(8)位，其次是·OH夺取m6A的N(6)H、N(6)甲基H及N(9)H。m6A与·OH的反应机理有别于腺嘌呤A与·OH，说明CH3取代影响了腺嘌呤A与·OH的反应机理。

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