七氟醚对神经发育期大鼠远期认知功能影响及机制探讨

何家璇，孟丽华，袁浩峥，张勇，吴刚

(西安交通大学第二附属医院麻醉科，陕西 西安 710004)

人类神经元系统在怀孕中期(孕18周)至出生后2年都是快速发育的时期，这段时间若受到外界因素影响，易致中枢神经系统受损。基础研究多选取大鼠为研究对象，由于属间差异，大鼠在出生25 d内其神经系统快速发育，此时期为大鼠的神经发育期，在此期间，大鼠海马突触生长高度活跃[1]。七氟醚是目前临床上常用的吸入麻醉药，具有无色、气味芳香、起效快速且作用时间短等优点，临床上广泛应用于小儿麻醉诱导或麻醉维持[2]。我国每年均有较多小儿手术或各种检查需行全身麻醉，但七氟醚对小儿远期认知功能是否产生影响及其作用机制仍不清楚[3]。因此，本文选择10日龄SD大鼠作为研究对象，探讨七氟醚对神经发育期大鼠远期认知功能损伤的机制，为临床小儿安全麻醉用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

选择清洁级SD雄性大鼠96只，7日龄，体重(14.1±2.9)g，来自西安交通大学医学院实验动物中心，实验动物取回后适应性喂养3 d后进行实验。实验遵循美国《实验动物管理和使用指南》。

1.2 试剂及仪器

七氟醚购自日本丸石制药株式会社，S/5多功能麻醉气体监测仪购自美国Datex-Ohmeda公司，MT-200 Morris水迷宫跟踪系统购自中国成都泰盟科技有限公司，BDFF抗体购自英国Santa公司，PSD-95抗体购自英国Bioss公司；突触蛋白-1购自英国Abcam公司，荧光二抗购自美国LICOR公司。

1.3 方法

将96只大鼠按照随机数字表法分为3组，每组32只。将其置于麻醉诱导箱中，空白组吸入空气，两七氟醚组通过调节七氟醚挥发罐及S/5多功能麻醉气体监测仪，七氟醚1组吸入2.8%七氟醚2 h，七氟醚2组吸入2.8%七氟醚4 h，氧流量为2 L/min，氧浓度为30%，以上3组处理均持续3 d，每组第2、3天处理保持与第1天相同时间段及相同的实验环境条件。七氟醚两组麻醉中观察大鼠有无口唇、指趾发绀及呼吸抑制等情况。

认知功能检验：空白组及七氟醚两组麻醉诱导30 d后，日龄40 d时，用MT-200Morris水迷宫综合跟踪系统行认知功能检验。划分水迷宫水池为4个象限，每个象限设置入水点标记，在第4象限放置隐蔽圆形平台，实验共6 d，包括5 d训练期及1 d探索期。训练期每天训练4次，从4个象限标记的入水点下水，期间记录各组大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期)；大鼠下水2 min找不到平台时，引导大鼠寻找隐蔽平台，找到后停留15 s，探索期撤去隐蔽平台，任意选择一点将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠2 min内穿越原隐蔽平台次数及在第4象限(即平台所在象限)滞留的时间。

BDNF、PSD95、突触蛋白-1水平检验：实验结束后，将空白组、七氟醚两组大鼠断头处死，取海马组织，用裂解液提取蛋白并测定蛋白浓度。用聚丙烯酞胺凝胶电泳对目的蛋白进行分离，冰浴转膜，用脱脂奶粉室温下封闭1～2 h，加入BDNF抗体、PSD95抗体、突触蛋白-1抗体，4 ℃孵育过夜，次日用荧光二抗孵育1 h，再用TBST清洗，用红外成像系统扫膜，再用Odessay软件对灰度值进行测定，以GAPDH内参，用目的条带灰度值对比GAPDH条带灰度值的比值，来反映目的蛋白的表达水平。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 3组BDNF、PSD-95及突触蛋白-1水平对比

由表1可见，七氟醚1组的BDNF、PSD-95、突触蛋白-1水平均明显低于空白组；七氟醚2组的BDNF、PSD-95、突触蛋白-1水平明显低于空白组及七氟醚1组，P<0.05。

表1 3组BDNF、PSD-95及突触蛋白-1水平对比

*P<0.05，与空白组比较；#P<0.05，与七氟醚1组比较。

2.2 3组水迷宫实验各指标对比

由表2可见，七氟醚1组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均明显高于空白组，穿越原平台位置次数、第4象限滞留时间均明显低于空白组，而七氟醚2组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均明显高于空白组及七氟醚1组，穿越原平台位置次数、第4象限滞留时间均明显低于空白组及七氟醚1组，P<0.05。

表2 3组水迷宫实验指标对比

*P<0.05，与空白组比较；#P<0.05，与七氟醚1组比较。

3 讨论

随着麻醉技术及外科手术的发展，全世界每年约有150万例小儿需接受全身麻醉[4]。小儿期的中枢神经系统多是发育的高峰期，10日龄大鼠脑生长期相当于人类年龄的1岁，其神经系统处在突触快速发育阶段，是神经系统容易受到损伤的阶段[5]。七氟醚血/气分配系数较低，麻醉诱导快、苏醒快，对患者气道刺激较小，在小儿全麻诱导及维持中有显著优势，但可能导致发育期脑组织的神经元凋亡，甚至损伤患儿的学习、记忆功能，目前其作用机制尚不明确。因此，本文探讨七氟醚影响神经发育期大鼠远期认知功能的机制，以为临床小儿安全麻醉用药提供依据。

大鼠的最低肺泡有效浓度(MAC)随着年龄的增加逐渐增加，10日龄大鼠的MAC值约为3.54%，本文10日龄大鼠七氟醚吸入2.8%七氟醚，接近临床小儿麻醉时常用的七氟醚浓度[6]，且并未引起大鼠呼吸、循环功能抑制。

水迷宫实验是一种用于动物行为学研究的经典方法，其重复性、稳定性好，记录大鼠逃避潜伏期时间可以反映大鼠的学习能力，记录穿越原平台位置次数、平台所在象限停留时间可反映大鼠的空间记忆能力。本文结果表明，七氟醚1组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均明显高于空白组，穿越原平台位置次数、第4象限滞留时间均明显低于空白组，表明吸入七氟醚2 h降低了大鼠的学习、记忆功能；而七氟醚2组第2、3、4、5天的逃避潜伏期均明显高于空白组及七氟醚1组，穿越原平台位置次数、第4象限滞留时间均明显低于空白组及七氟醚1组，表明吸入七氟醚4 h较未吸入、吸入2 h对大鼠的学习、记忆功能影响更大，七氟醚麻醉可能会引起大鼠远期认知功能障碍，且影响程度与七氟醚吸入时间有关，吸入时间越长，认知功能损害越严重。

大脑海马突触可塑性与学习、记忆、情绪、行为等功能密切相关，是学习记忆的神经生物学基础，BDNF、PSD-95、突触蛋白-1对突触的发生、稳定及可塑性调节有重要作用。BDNF支持神经元发育、分化及维持，可促进受损神经元的恢复，参与突触可塑性，来维持中枢神经系统学习及记忆功能；PSD-95可调节谷氨酸受体功能，在突触传递中有重要作用，会对突触后可塑性造成影响；突触蛋白-1对突触囊泡中神经递质释放进行调控，也会影响突触前可塑性[7-8]。本文结果表明，七氟醚1组的BDNF、PSD-95、突触蛋白-1明显低于空白组；七氟醚2组的BDNF、PSD-95、突触蛋白-1明显低于空白组及七氟醚1组，表明随着七氟醚吸入时间的延长，BDNF、PSD-95、突触蛋白-1蛋白水平逐渐降低，说明七氟醚降低了神经发育期大鼠的BDNF、PSD-95、突触蛋白-1水平，而通过抑制海马神经元突触可塑性，影响大鼠的远期认知功能。

综上所述，七氟醚可能通过降低BDNF、PSD-95、突触蛋白-1水平，抑制海马神经元突触可塑性来影响大鼠的远期认知功能，影响程度随麻醉时间延长而增加，因此临床小儿应用七氟醚麻醉时，应尽量缩短麻醉时间。

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