山羊Wnt10b的原核表达和多克隆抗体制备

马洁琼，林亚秋，朱江江，黄 凯，王 永

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041)

Wnt家族属于能够调控不同的发育过程的分泌蛋白家族，Wnt蛋白通过分泌作用与细胞膜上的受体结合而发挥生物学功能，它在细胞的增殖、分化、迁移、极性化以及凋亡过程有着极其重要的作用[1].其中，主要存在于细胞外基质中的Wnt10b是Wnt家族成员之一，通过与细胞膜上相应受体的结合调控其下游靶基因的表达，属于分泌型跨膜蛋白[2]，有研究表明，Wnt10b具有维持毛乳头细胞生物活性的功能，又可通过经典的Wnt通路诱导未成熟的胚胎表皮细胞分化[3]，在脂肪的生成过程中Wnt信号通路起关键作用[4]，Wnt10b基因亦与脂质代谢密切相关，是一种有效的脂肪生成抑制剂[5-6].

Wnt10b蛋白中无规则卷曲相对松散，可能包含有B细胞的优势抗原表位[7]，杨祖等[2]也研究发现，绵羊Wnt10b蛋白具有3个潜在的抗原表位，这为本研究进行免疫提供了理论基础.本实验室前期研究发现，在调控山羊前体脂肪细胞分化过程中该基因可能发挥重要作用[8]，为进一步探索Wnt10b在山羊脂质代谢中的作用及机制，本研究在克隆得到山羊Wnt10b基因序列基础上进行原核表达、纯化、制备多克隆抗体，为后续探讨该基因在山羊脂代谢过程中的功能和作用机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

采取简州大耳羊公羊背部皮下脂肪，锡箔纸包裹装入冻存管，放入液氮罐中带回实验室备用.2月龄雌性新西兰大白兔一只用以免疫.大肠杆菌BL21(DE3)、表达载体pET-32a(＋)及DH5a感受态细胞均由实验室保存；T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶以及DS5000 marker购自Takara公司；Taq DNA聚合酶购自东盛公司；氟氏完全佐剂、氟氏不完全佐剂、PEG4000、HT及HAT购自Sigma公司；HRP标记的羊抗兔IgG购自KPL公司.

1.2 方法

1.2.1 脂肪组织总RNA提取

于液氮下充分研磨脂肪组织，TRIzol法提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度为OD260/280＝1.9～2.0的总RNA完整性.

1.2.2 PCR引物设计及合成

根据 GenBank中山羊Wnt10b预测序列，使用PrimerPremier 5.0软件设计含有酶切位点的引物，设计序列为:P1:5'-GGAATTCAATGAGATTC TGGGCTTGAA-3'(划线处为EcoRI酶切位点)，P2:5'-ACGCGTCGAC TTAGTGGTGG TGGTGGTGGTGCTTACACACATTGACCCACT-3'(划线处为SalI酶切位点)，以皮下脂肪组织cDNA单链为模板进行PCR扩增，反应体系为 25 μL 如下:模板 cDNA 1.0 μL，2 × Long Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10μmol·L-1上、下游引物各 1.0 μL，9.5 μL ddH2O.循环反应条件:预变性94℃ 4 min；94℃20 s变性，退火60℃ 60 s，延伸72℃ 90 s；39个循环数后72℃再延伸10 min.将经凝胶电泳检测、试剂盒回收纯化后的PCR产物与pMD-19T载体连接，并转化至感受态细胞DH5α，为确保所需基因序列的正确性，挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定.

1.2.3 原核表达质粒的构建及鉴定

将序列正确的Wnt10b/pMD19-T质粒DNA和pET32a载体分别用限制性内切酶EcoRI、SalI进行双酶切，胶回收酶切产物，并对Wnt10b和双酶切后的原核载体使用T4 DNA连接酶进行连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)并涂布于含氨苄青霉素的LB平板上选取阳性菌落，质粒经双酶切和PCR鉴定后进行DNA测序，将测序正确的重组质粒命名为pET32a-Wnt10b.

1.2.4 重组质粒pET30a-Wnt10b的小量诱导表达鉴定

将测序正确的阳性重组质粒pET32a-Wnt10b和pET32a空载体转化至感受态大肠杆菌L21(DE3)，挑取单菌落于5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日，菌种以1:50扩大培养5 mL，37℃摇床培养至OD600＝0.4～0.6时收取2.5 mL菌种，处理后将其作为诱导前对照.剩余部分加入0.5 mmol/L的IPTG经小量诱导，37℃诱导3 h，同时将离心所收菌体处理作为诱导后样品，SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况.

1.2.5 重组蛋白的纯化、复性与复溶

将过夜活化的菌种以1:50扩大培养至800 mL，37℃摇床培养至 OD600＝0.4～0.6时加入 0.5 mmol/L IPTG诱导5 h，4℃离心5 min并收集菌体后加入100 mL破碎液进行冰浴超声裂解细胞功率300 W，超声2s，间歇2s，60个循环，对重组蛋白4℃高速离心(10 000 r/min)15 min，为检测其表达形式，对收集的上清和沉淀进行SDS-PAGE.纯化重组蛋白用6 mol/L盐酸胍溶解Wnt10b包涵体，运用高亲和性NI树脂纯化Wnt10b蛋白，收集流穿液、洗脱液，SDSPAGE检测纯化效果.梯度尿素复性Wnt10b蛋白，沉淀后8 mol/L尿素对重组蛋白进行复溶.

1.2.6 多克隆抗体的制备及鉴定

将Wnt10b蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混合均匀，对新西兰大白兔采用大腿肌肉多点注射法，初次免疫28天后使用Wnt10b蛋白与弗氏不完全佐剂混合物进行第二次免疫.第二次皮下注射14天后，静脉采血获得兔免疫血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，通过ELISA间接法测抗体效价，确定是否产生针对目标的抗体.效价达标之后第三次用等量生理盐水混合，采用耳静脉直接注射法，进行加强免疫；若效价不达标，则第三次继续使用弗氏不完全佐剂进行皮下注射免疫，28天后对新西兰大白兔进行第四次加强免疫.于加强免疫14天后采血，进行抗血清的效价的测定，抗血清处理OD450 nm/阴性对照处理OD450 nm＞2.1即可确定效价达到相应的稀释度，最大稀释倍数即为效价[9]，制备的抗原小量多支分装，冻存于-80℃.

2 结果

2.1 山羊Wnt10b基因扩增

检测RNA质量符合试验要求，经克隆得到长1232 bp，编码391个氨基酸的Wnt10b基因序列，其与NCBI登录的山羊Wnt10b基因保守区cDNA序列(登录号:KU950832)一致.

2.2 表达产物的分析

SDS-PAGE分析pET32a-Wnt10b诱导表达产物显示，当IPTG浓度达到0.5 mmol/L，诱导温度和诱导时间分别为37℃ 5 h时，Wnt10b蛋白的表达以包涵体形式为主(图1a).经变性和高亲和性NI树脂纯化、复性、复溶，最终得到用500 mmol/L咪唑洗脱液洗脱，纯度为90%浓度为0.6 mg/mL及蛋白含量为5 mg的Wnt10b重组蛋白最佳(图1b).经细胞破碎，包涵体溶解，镍柱亲和层析纯化后获得分子量约为63 kD，纯度较高的Wnt10b蛋白(图1c).

图1 ET32a-Wnt10b(BL21)蛋白表达形式的鉴定、包涵体纯化和产物a PET32a-Wnt10b(BL21)蛋白表达形式的鉴定1:包涵体2:上清；b PET32a-Wnt10b(BL21)包涵体纯化1-5:500、200、80、40、20 mM咪唑洗脱液6:流出液；c ET32a-Wnt10b(BL21)蛋白成品1:Wnt10bFig.1 Identification of PET32a-Wnt10b(BL21)protein expression，inclusion body purification and product a Identification of PET32a-Wnt10b(BL21)protein expression.1 Inclusion body 2 Supernatant；b PET32a-Wnt10b(BL21)inclusion body purification.1-5:500，200，80，40，20 mM imidazole eluent；6:effluent；c PET32a-Wnt10b(BL21)protein product 1:Wnt10b

2.3 抗体效价的测定

免疫后抗血清测定采用间接ELISA法，测得效价约为1:243 000.

3 讨论

研究表明，成骨细胞和脂肪细胞的分化与Wnt10b有关[10]，该基因又可诱导细胞增殖；Wnt10b过表达可促进细胞发育[11]，并且Wnt10b对经典Wnt信号传导的激活抑制了体外前脂肪细胞的分化[12].此外，它在启动毛囊的形态发生和发育中具有重要作用[13-14].且已有研究发现在Wnt10b基因猪的肌肉、心、肝、脾以及皮下脂肪等组织中均有表达，且在肝中表达量最高[15]，且在该基因在山羊各组织中有广泛表达，尤脂肪组织中表达水平最高[8].有关山羊Wnt10b基因的研究和抗体的制备目前尚未见报道，特异性抗体是研究基因功能重要的工具之一，本试验根据蛋白的氨基酸序列，去除其1-28aa信号肽区域，RT-PCR技术扩增获得目的片段并将其与原核表达载体pET32a连接，进而转入原核表达工程菌 BL21(DE3)中，成功构建了Wnt10b/PET32a(＋)-BL21基因工程菌，IPTG诱导，获得带有组氨酸标签相对分子量为63 kD的Wnt10b重组蛋白，试验溶解包涵体时最初选用8 mol/L尿素溶液，但结果显示溶液中仍有部分蛋白质以沉淀形式存在.随后将目的蛋白经镍亲和层析柱，500 mmol/L咪唑洗脱，透析后最终得到浓缩的重组蛋白.以得到的重组蛋白为抗原对新西兰大白兔进行三次免疫，制备所需多克隆抗体，为山羊Wnt10b基因功能的研究提供了有力工具.本研究获得了灵敏度较高的Wnt10b多克隆抗体，ELISA检测免疫后抗血清效价达到1:243 000，为进一步对山羊脂肪中Wnt10b蛋白功能研究提供参考价值.

综上所述，本研究利用pET-32a(＋)原核表达载体系统成功构建了Wnt10b/pET32a(＋)-BL21(DE3)工程菌.将纯化所得蛋白作为抗原，免疫新西兰大白兔，成功的获得兔抗山羊Wnt10b的多克隆抗体血清.血清抗体与抗原特异性结合，经优化获得抗体的理想效价，为检测蛋白表达差异奠定基础.

[1] YANG YZ.Wnt signaling in development and disease[J].Cell Bioscience，2012，2(1):14.

[2] 杨祖，崔凯，王建魁，等.绵羊Wnt10b基因克隆及生物信息学分析[J].中国畜牧杂志，2016，52(7):11-15.

[3] OUJI Y，YOSHIKAWA M，MORIYA K，et al.Wnt-10b，uniquely among Wnts，promotes epithelial differentiation and shaft growth.[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2007， 367(2):299-304.

[4] HULELSKEN J，BEHRENS J.The Wnt signalling pathway[J].Journal of Cell Science，2002，115(21):3977-3978.

[5] BENNETT CN，ROSS S E，LONGO K A，et al.Regulation of Wnt signaling during adipogrnesis[J].Journal of Biological Chemistry，2002，207(34):30998-31004.

[6] CAWTHOM WP，BREE AJ，YAO Y，et al.Wnt6，Wnt10a and Wnt10b inhibit adipogenesis and stimulate osteoblastogenesis through a β-catenin-dependent mechanism.[J].Bone.2012；50(2):477-489.

[7] GERHARD D S，WAGNER L，FEINGOLD E A，et al.The status，quality，and expansion of the NIH full-length cDNA project:the Mammalian Gene Collection(MGC)[J].Genome Research，2004，14(10B):2121-2127.

[8] 林森，林亚秋，朱江江，等.山羊Wnt10b基因生物学特征及组织细胞表达模式分析[J].基因组学与应用生物学，2017，36(10):4070-4078.

[9] 刘沙洲.新霉素人工抗原的构建、多克隆抗体的制备及检测方法的初步研究[D].成都:四川大学，2007.

[10] COLLINS FL，RIOS-ARCE ND，MCCABE LR.Cytokine and hormonal regulation of bone marrow immune cell Wnt10b expression[J].PLoS ONE，2017，12(8):e0181979.

[11] KHAN S，BASIT S，ZIMRI FK，et al.A novel homozygous missense mutation in WNT10B in familial split-hand/foot malformation[J].Clinical Genetics，2012，82(1):48-55.

[12] LONGO KA，WRIGHT WS，KANG S，et al.Wnt10b inhibits development of white and brown adipose tissues[J].Journal of Biological Chemistry.2004，279(34):35503-33309.

[13] 孙远，李瑶，鲍忠省，等.Wnt10b基因对鹅胚胎期毛囊形成及发育的影响[J].吉林农业大学学报，2014，36(3):338-341.

[14] 李常红.吉林白鹅绒用品系皮肤及毛囊生长发育规律研究[D].长春:吉林农业大学，2006.

[15] 杨映娟，李惠侠，杨公社.猪Wnt10b基因cDNA的克隆及生物信息学分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2008(07):679-683.