当归调经养血合剂提取工艺研究

广东省阳江市中医医院，广东 阳江 529500

当归调经养血合剂为我院妇科常用的临床经验方，由山茱萸[1]等13味中药组成，具有补血，益气、填精功效、治气血衰弱，肾精不足所致月经后期、月经过少、闭经、痛经、更年期综合症、不孕等症。马钱苷为方中主药山茱萸的主要有效成分，具有调节免疫、抗炎、降血糖等多种功效[2]。本研究采用正交实验法，以水煎提取液中马钱苷的含量和相对密度为考察指标，对当归调经养血合剂的水提取工艺进行优选，为其进一步的研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津公司LC-20AD高效液相色谱仪(LabSolutions色谱工作)站；SB25-12DTD型数控超声清洗器(上海新芝生物科技股份有限公司)；AB 135-S十万分之一电子天平(梅特勒-托利多)；AB204-N型万分之一天平(梅特勒-托利多)；超纯水机(北京历元电子仪器)。

1.2 材料 马钱苷对照品(批号110640-201606，中国食品药品检定研究院)；乙腈(色谱纯，批号：1307184A，默克股份两合公司)；甲醇(色谱纯，批号：1301095A，默克股份两合公司)；所用试剂水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计 根据预试验及生产实践，当归调经养血合剂提取工艺采用水煎煮提取的方式，影响水提效果的主要因素为加水量(A)，提取时间(B)、提取次数(C)[3-4]。 选用L9(34)正交设计试验。见表1。

表1 正交因素水平表

2.2 样品提取液的制备 按处方比例称取9份混合中药饮片，按拟定的正交试验方案进行水煎煮提取。每份加水后均浸泡1 h，所得煎煮液浓缩至100 mL，相当于每1 mL含生药0.77 g。

2.3 相对密度 按《中国药典》2015年版第四部通则0601相对密度测定法测定。

2.4 马钱苷含量测定[5-7]

2.4.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(10∶90)；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；柱温；25 ℃；进样量：10μL。马钱苷对照品，当归调经养血合剂样品和缺山茱萸的阴性对照样品的HPLC色谱。如图1所示。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷对照品6.64 mg，置100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液(质量浓度为0.0664 mg/mL)。精密量取3 mL对照品储备溶液，置10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液(质量浓度为0.0199 mg/mL)。

2.4.3 供试品溶液的制备 分别精密吸取“2.2”项下浓缩液各5 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，取过滤液为供试品溶液。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取对照品储备溶液1、2、3、4、5、6 mL分别置于10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，配制成0.0066、0.0133、0.0199、0.0265、0.0332、0.0398 mg/mL的系列溶液，分别吸取上述溶液各10 μL，进行进样测定，以纵坐标(Y)为峰面积，以横坐标(X)为质量浓度(mg/mL)进行线性回归，得线性方程为Y=21905X-0.9030，相关系数r=0.9999。线性范围在0.0066～0.0398 mg/mL，呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，每次进样10μL，按上述色谱条件测定，以峰面积计算，RSD值为0.23%(n=6)。结果表明仪器的精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别放置0、1、2、4、8、24 h后，按上述色谱条件测定色谱峰面积，RSD值为1.13%(n=6)，结果显示在24 h内供试品溶液稳定性相对良好。

2.4.7 重复性试验 精密量取同批次样品各6份，按“2.4.3”供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，测定并计算马钱苷含量，结果含量的RSD值为0.01%(n=6)，结果表明该方法具有良好的重复性。

2.4.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的同一批供试品溶液6份，分别加入相当于各对照品溶液80%、100%和120%的量，在“2.4.1”色谱条件下检测马钱苷的回收率分别为99.13%、100.45%、100.93%，平均回收率为100.21 %；RSD值为3.68 %(n=6)，该方法回收率良好。见表2。

表2 加样回收率试验

2.5 结果与分析

2.5.1 水煎提取正交试验结果 根据L9(34)正交试验，以马钱苷含量和水提取液相对密度为主要考核指标，设定权重系数分别为0.6、0.4，综合评分=(相对密度/最大相对密度)×0.4×100+(马钱苷含量/最大马钱苷含量)×0.6×100。研究选择提取次数、加水量、提取时间为主要考察因素，由表3可见其影响顺序为C(提取次数)>A(加水量)>B(提取时间)，水平影响次序为A3>A2>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，故最佳提取工艺为A3B3C2。再经方差分析结果(表4)可知提取次数(C)和加水量(A)对提取效果影响显著，为主要因素，提取时间(B)对提取效果无明显影响，为次要因素。考虑节约成本，将B3调整为B2。调整最优的提取工艺为A3B2C2，即8倍的加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5 h。

表3 水煎提取正交试验结果

表4 方差分析结果

注:F0.05(2,4)=6.94，F0.01(2,4)=18.00

2.6 验证试验 称取与正交试验等量饮片3份，按优选的提取工艺提取，测得相对密度的RSD为0.08%，马钱苷含量RSD为0.81%，表明优选的工艺稳定可行。见表5。

表5 验证试验结果

3 讨论

有研究曾以方中君药当归中的阿魏酸作为含量测定指标成分，发现阿魏酸含量测定的方法学验证中专属性不强，阴性对照液相色谱图的干扰成分除了来自川芎的阿魏酸成分干扰，还来自其它药材的阿魏酸成分干扰[9-10]。故没有选择当归中的阿魏酸为提取工艺指标，而选择臣药山茱萸中的马钱苷作为提取工艺的指标。

山茱萸主要成分有环烯醚萜类化合物，而马钱苷是山茱萸补益肝肾的主要药效物质，且其水溶性和热稳定性相对良好，故研究选择马钱苷含量作为提取工艺主要的评价指标进行综合评分。另外方中饮片成分水溶性强，出膏率大，故选择能反映出膏率大小的相对密度作为评价指标之一，并在综合加权评分赋予相对密度40%的比重。此外，综合分析本组研究情况，精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验和验证试验等结果均良好，正交试验的方差分析结果也准确可靠，达到了优选出当归调经养血合剂的最佳提取工艺的目的。当归调经养血合剂中山茱萸主要成分马钱苷的最佳提取工艺为8倍的加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5 h，可作为后续相关提取研究的基础和参考。

实验未对提取液的最佳pH条件进行分析，仅以马钱苷作为指标成分和相对密度进行优选，研究仍存在一定局限性。但本次工艺研究最大的意义在于采用水溶液为提取溶剂，既能最大限度地节约成本，同时也能高效提取马钱苷，适合工业化生产。

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