骨疏宁口服液提取工艺的研究

广西壮族自治区玉林市中西医结合骨科医院，广西 玉林 537000

骨疏宁方是全国名老中医赖祥林的经验方，由淫羊藿、骨碎补、制何首乌、丹参、续断等中药组成，主治老年性骨质疏松症。前期试验表明骨疏宁方有抗维甲酸及去卵巢所致大鼠骨质疏松症作用；可治疗原发性骨质疏松症及骨质疏松症引起的骨折、骨痛[1-4]。为推广该方在临床上的应用，结合本方各药主要有效成分易溶于水的特点，拟将该方开发成口服液体制剂。本实验采用单因素考察、正交试验设计，以淫羊藿苷含量及干膏量为指标，优选骨疏宁口服液最佳提取工艺。

1 实验药材与仪器

1.1 药材与试剂 淫羊藿、骨碎补、制何首乌、丹参、续断等十九味中药均购自玉林市平安堂中药饮片有限公司，经鉴定，均符合《中国药典》2015年版相关项下要求。淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号110737-200415)，乙腈(Fisher；色谱纯)，95%乙醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。

1.2 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津)，AB204-S型电子分析天平(梅特勒-托利多公司)，DHG-9006型9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏)

2 实验方法与结果

2.1 淫羊藿苷含量的测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为C18柱(Inertsil ODS-SP， 5μm，4.6 mm×150 mm)，流动相为乙腈-水(30∶70)；流速为1 mL/min，检测波长为270 nm，进样量为10μL。理论塔板数以淫羊藿苷计算为1500。

2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品0.0135 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品母液。精密吸取1.0 mL对照品母液置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(0.0108 mg/mL)。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取药材，加20倍水，浸泡30 min后，煎煮2 h，滤过，浓缩，定容至100 mL容量瓶中作为供试品储备液。精密量取上述储备液10 mL，置聚酰胺层析柱(100～200目，6 g，内径为1.5 cm)上，用蒸馏水100 mL洗脱，水洗液弃去，再用95%乙醇100 mL洗脱，收集醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定量转移至10 mL量瓶中并定容，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即为供试品溶液，检测结果如图1所示。

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取2.1.2项下对照品贮备液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL，按2.1.1项下的色谱条件进行测定，以对照品进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。结果表明淫羊藿苷对照品进样量在0.06～0.36 μg范围内与峰面积线性关系良好。回归方程为y=1940560.35x-274.13(R2=0.9999，n=6)。

2.2 干膏量的测定 精密量取供试品贮备液50 mL，置经105 ℃干燥至恒重的蒸发皿中，蒸干，105 ℃干燥3 h，取出冷却，称定重量，计算药材的干膏量。

2.3 单因素考察与结果

2.3.1 提取时间的研究 按处方比例称取一定量的药材，各加入20倍的水，浸泡30 min后，分别煎煮1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，滤过，滤液浓缩至100 mL，测定淫羊藿苷含量及药材干膏量。实验结果发现提取2.5 h、3 h、3.5 h的淫羊藿苷含量趋平，因此，选择提取时间2.5 h、3 h、3.5 h设计正交试验。见表1。

表1 提取时间研究结果

2.3.2 提取次数的研究 按处方比例称取一定量的药材，各加入20倍的水，浸泡30 min后，分别提取1次(时间3.5 h，加水20倍)、2次(时间2 h+1.5 h，加水11倍+9倍)、3次(时间1.5 h+1 h+1 h，加水8倍+6倍+6倍)，滤过，收集滤液，测定淫羊藿苷含量和药材的干膏量，确定最佳提取次数。随着提取次数的增多，淫羊藿苷含量、干膏量均逐渐增大，但2次以后，淫羊藿苷含量、干膏量均增长缓慢，为减少能耗，选择提取1次、2次、3次设计正交试验。见表2。

表2 提取次数研究结果

2.3.3 提取倍数的研究 按处方比例称取一定量的药材，分别加18(10+8)倍、20(11+9)倍、22(12+10)倍、24(13+11)倍、26(14+12)倍的水，浸泡30 min后，煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h，滤过，收集滤液，测定淫羊藿苷含量和药材的干膏量，确定最佳提取倍数。随着提取倍数的增加，淫羊藿苷含量、干膏量逐渐增加，22倍后增加缓慢，不适当的增加提取溶剂，不仅浪费溶剂、能源，还给后续的浓缩工艺加大难度，因此，选择20倍、22倍、24倍设计正交试验。见表3。

表3 提取倍数研究结果

2.4 正交试验优选最佳提取工艺

2.4.1 因素水平设计 通过单因素试验确定了提取时间、提取次数、提取倍数的因素范围，并在其基础上确定以下因素及水平。见表4、5。

表4 提取工艺正交试验因素水平表

表5 骨疏宁口服液提取工艺正交试验因素水平表

2.4.2 正交试验设计 选用L9(34)正交试验，以药效成分淫羊藿苷含量及评价中药提取效果的参考指标干膏量的综合评分为指标，进行综合加权评分，考察各因素对提取工艺的影响。本研究采用经验性权重法，根据评价指标的重要性确定权重系数：淫羊藿苷含量为60，干膏量为40。综合评分=淫羊藿苷含量/最大淫羊藿苷含量×60+干膏量/最大干膏量×40。正交试验设计及结果见表6。

表6 骨疏宁口服液提取工艺正交试验设计及结果表

续表6

表6 骨疏宁口服液提取工艺正交试验设计及结果表

2.4.3 方差分析结果 根据正交试验分析结果和直观分析可知，主次因素依次为C>B>A，即提取次数影响最大，其次为提取时间、提取倍数，最佳试验条件为A1B3C2，即处方药材分次加20(11+9)倍水，煎煮2次，第一次2 h，第二次1.5 h。见表7。

表7 骨疏宁口服液提取工艺正交试验方差分析

注：F005(2，2)=19；F001(2，2)=99

2.6 最佳提取工艺验证 根据正交试验优选出的最佳提取工艺，进行了3批样品的验证试验，综合评分RSD为1.83%，结果表明该提取工艺稳定，可行，重复性好。工艺验证结果见表8。

表8 工艺验证结果

3 讨论

方中君药淫羊藿作为常用的补肾健骨中药被广泛应用于中医骨科临床，并对治疗各种骨伤疾病有显著疗效，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分，具有促进骨细胞增殖与分化的功能[5]，是反映该制剂药效的一个重要指标；干膏量是药效物质的总和，是制剂发挥疗效的物质基础，故本实验以淫羊藿苷含量及干膏量作为优化水提工艺的指标。

本方含19味中药，成分复杂，曾对该制剂水煎液，干膏不同浓度的醇溶液进行高效液相色谱测定条件摸索，发现杂质峰较多，故采用聚酰胺进行净化处理，先用蒸馏水洗脱，除去杂质，再用95%乙醇洗脱[6]，结果发现作为本制剂的君药淫羊藿的主要有效成分淫羊藿苷色谱峰明显，且易于定量分析。

本研究先通过单因素试验确定骨疏宁口服液提取工艺各因素的因素范围，再通过正交试验对其水提工艺进行了优化筛选，综合评价了试验结果及方法的可行性，并进行重复性验证试验，最终确定了本制剂的最佳水提工艺为处方药材分次加20(11+9)倍水，煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h。该提取工艺操作性强，稳定性好，为骨疏宁口服液的开发提供了依据。

[1]吕琳，庞声航，曾翠琼，等.骨疏宁颗粒对维甲酸致大鼠骨质疏松的影响[J].广西中医学院学报，2008，11(1)：3-5.

[2]庞声航，曾翠琼，吕琳，等.骨疏宁颗粒治疗去卵巢后骨质疏松大鼠的实验研究[J].广西中医药，2008，31(2)：54-56.

[3]李永斌，李开静，赖祥林.骨疏宁治疗原发性骨质疏松症骨痛63例[J].辽宁中医药大学学报，2007，9(6)：115.

[4]陈涛，黎观保，贾世青，等.经皮椎体成形术联合骨疏宁片治疗胸腰椎椎体骨折的临床疗效分析[J].中国临床新医学，2016，9(3)：201-204.

[5]戈勋，曹广尚，孙洪胜，等.淫羊藿苷活性成分促进骨细胞增殖分化研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2018，24(3)：247-253.

[6]韩丽萍，陈行愉，邓伟民. HPLC法同时测定补肾壮骨颗粒中柚皮苷和淫羊藿苷的含量[J].中成药，2011，33(1)：184-186.