水稻OsMPK15的cDNA克隆和转录水平分析

石佳 杨丹丹 葛慧雯 杜京尧 梁卫红

（河南师范大学生命科学学院，新乡 453007）

促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一类丝氨酸/苏氨酸（Thr/Ser）蛋白激酶，普遍存在于哺乳动物、高等植物和真菌等高等真核生物体内［1］。MAPK的结构和功能在进化中都是高度保守的。由MAPK介导的细胞信号转导参与了包括细胞分裂、细胞分化以及多种胁迫应答过程，并且MAPK还涉及激素介导的信号通路［2］。

研究显示，植物的MAPK家族参与了调控植物生长发育的过程，包括配子形成、胚胎发育、形态发生、衰老、脱落、受精和种子的形成［3］。如MAPK家族可以作为受体样激酶（Receptor-like kinase，RLKs）的下游信号分子参与调节植物的生长发育过程，其中对拟南芥AtMPK3和AtMPK6研究较为深入，其能作为RLKs的下游信号分子参与调节植物生长发育、细胞通讯过程［4-6］。有研究显示，烟草MAPK级联信号通路NPK1-NQK1-NRK1在调控细胞分裂中发挥重要的作用［7-9］。植物的MAPK还参与逆境胁迫以及激素信号应答。如拟南芥MAPK级联反应中，AtMKK1或AtMKK2通过激活下游的AtMPK4，不仅调控水杨酸（Salicylic acid，SA）的积累、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的平衡，还对低温、高盐和机械损伤等非生物胁迫也能作出响应［10-12］。

水稻MAPK同样参与了水稻的生长发育、生物胁迫应答和非生物胁迫应答过程，有些MAPK与调控植物激素信号通路有关，如OsMPK6的活性能被白叶枯病菌的侵染所激活，从而引起抗逆植物激素的积累，活化茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和水杨酸信号通路，进而上调抗病基因的表达量，增强植株局部对白叶枯病菌的抗性［13-14］。OsMPK5参与水稻对高盐、干旱、紫外、臭氧、重金属、高温及低温胁迫等几乎所有非生物胁迫应答过程［15-16］；OsMEK1-OsMAP1级联通路则广泛参与了水稻的低温胁迫应答过程［17］。尽管许多MAPK参与水稻的生物与非生物胁迫应答及生长发育过程［2］，但其生物学功能和作用机制仍有待深入研究。

本实验室前期对水稻MAPK家族成员OsMPK14的研究显示，该基因参与多种水稻非生物胁迫应答过程［18］，水稻功能未知基因OsMPK15与其同源性最高。为此，本研究拟克隆OsMPK15的cDNA编码区，并通过qRT-PCR技术检测OsMPK15的表达特性，旨为后续的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻材料为粳稻品种日本晴（Oryza sativa L.

japonica.cv. Nipponbare）。克隆载体pEASY-T载体和高纯度质粒小提试剂盒购自北京全式金有限公司，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由河南师范大学生命科学学院植物发育分子细胞生物学实验室保存。TRIzol总RNA提取试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR®Premix Ex TaqTM、限制性内切酶均购自大连宝生物公司；植物激素脱落酸（Abscisic acid，ABA）、水杨酸、茉莉酸、聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG6000）、氯化钠（Sodium chloride）、氨苄霉素（Ampicillin）购于北京鼎国生物公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗的种植及处理 取日本晴水稻种子若干置于小烧杯中，用75%的酒精消毒30 s，再用无菌水冲洗5-6次，每次冲洗1 min。用无菌水完全淹没种子，浸泡1 h。将种子转移至培养皿中，加入适量的水（不能完全淹没种子），28℃黑暗培养2-3 d。待种子长出幼芽后，采用人工气候箱进行培养，培养条件为28℃、光照强度16 000 lx、光照时间为16 h/d。将水培生长15 d的水稻幼苗转移到培养皿中。待水稻幼苗适应2 d后，分别用含有150 mmol/L NaCl（盐胁迫）、30% PEG6000（模拟干旱胁迫）、100 μmol/L JA、100 μmol/L SA 和 100 μmol/L ABA的Yoshida培养液［19］处理水稻幼苗，处理方法参照张静等［20］方法进行。分别在处理0、3、6、9、12和24 h后取水稻幼苗的根组织适量，经液氮速冻后，保存于-80℃超低温冰箱中备用。

1.2.2 水稻的大田种植及取材 试验田平整、浸泡作为苗床育苗，2014年5月1日将种子分散播种至苗床，加水淹没苗床，2014年5月25日进行分苗，在水稻生长至幼穗期取其根、茎、叶、叶鞘、幼穗（生长至1-2 cm、3-5 cm、5-8 cm）组织，液氮速冻后保存于-80℃冰箱。

1.2.3 总RNA的提取和cDNA的合成 采用TRizon法提取上述组织的总RNA，经快速电泳，检测确认后，按照反转录试剂盒说明书，配制反转录反应体系，制备cDNA。

1.2.4 水稻OsMPK15的cDNA编码区的克隆 以上述制备的水稻根组织的cDNA为模板，用根据水稻OsMPK15编码框设计引物P1/P2，扩增OsMPK15的cDNA编码区。PCR反应体系为cDNA 1 μL、上下游引物各 0.5 μL、dNTP 2.5 μL、5×Taq buffer 5 μL、Taq酶 0.5 μL，加 ddH2O 至终体积 50 μL；反应程序为 95℃ 2 min ；95℃ 20 s，53℃ 20 s，72℃ 1 min，40个循环；72℃ 5 min；4℃保存。以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带。取3 μL回收产物与pEASY-T载体（含T4连接酶）连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化产物涂布于含有100 μg/mL Ampicillin的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。挑取LB固体培养基的单克隆，接种至5 mL含有100 μg/mL Ampicillin的LB液体培养基中，37℃，200 r/min，震荡培养过夜，双酶切鉴定后测序。将测序获得的OsMPK15的cDNA编码区提交至 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列分析和同源检索。采用DNAMAN软件进行序列比对，绘制系统发育树。引物（表1）均委托苏州金唯智生物公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.5 水稻OsMPK15不同组织中的表达分析 以组成型表达的OsActin1为内参基因进行实时定量荧光PCR检测，以反转录制备的各个组织样品的cDNA为模板，采用P3/P4和P5/P6引物组合分别扩增OsMPK15和OsActin1。荧光定量反应体系为SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L） 各 0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，加 ddH2O 至终体系 20 μL。使用ABI 7500 实时PCR仪（Applied Biosystems）进行PCR扩增。反应采用两步法PCR扩增标准程序95℃30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s，40个循环。每个组织进行3次重复，采用2-△△Ct法分析结果，数据统计采用Excel软件，显著性分析采用Spass v19.0软件。

1.2.6 OsMPK15对非生物胁迫和激素的响应分析取经过干旱、高盐、激素处理的水稻幼苗根组织，以组成型表达的OsActin1为内参基因，进行OsMPK15的qRT-PCR分析，操作同1.2.5。

2 结果

2.1 水稻OsMPK15的cDNA编码区的克隆

以提取的总RNA反转录得到的cDNA为模板，P1/P2为引物，扩增得到1条约1 500 bp的特异性片段，与预期的OsMPK15序列的cDNA编码区序列大小符合（图1-A）。将上述PCR产物进行胶回收，与pEASY-T载体连接。将连接产物转化大肠杆菌，筛选转化子。挑取若干单菌落分别扩大培养，提取质粒进行双酶切鉴定（图1-B）。将筛选到的阳性克隆进行测序，测序结果显示，通过RT-PCR技术克隆的OsMPK15序列与文献推测的序列［21］一致，OsMPK15的cDNA编码区长1 497 bp，预期编码498个氨基酸和1个终止密码子。

图1 OsMPK15的cDNA编码区的扩增和克隆

2.2 水稻OsMPK15的序列分析

将OsMPK15的cDNA编码区序列提交至NCBI，分析其编码蛋白的保守结构域，发现该蛋白在第13-304处的氨基酸对应MAPK特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。利用DNAMAN软件，对水稻MAPK家族E组的3个成员OsMPK13、OsMPK14和OsMPK15进行比对（图2），发现尽管构成3种蛋白的氨基酸数目不同，但是序列同源性很高，尤其是N端序列相似性很高，其序列差异主要体现在C端；且丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域具有高度保守性，都具有TDY基序。其中OsMPK14和OsMPK15蛋白同源性达到82.87%。

将OsMPK15蛋白质序列提交至NCBI进行BLAST检索，选择其中11种同源性较高的，来自花生、番茄、葡萄、卷柏、小麦、拟南芥、烟草、棉花及苜蓿的MAPK，采用DNAMAN软件进行多序列比对分析，结果（图3）显示，与水稻OsMPK15相似性最高的是小麦TaMPK2，同源性高达79.78%，提示二者可能是同源基因。

图2 水稻MAPK家族E组3个成员的氨基酸序列比对

图3 基于水稻OsMPK15与其他植物MAPK序列构建的系统发育树

2.3 OsMPK15在幼穗期水稻中的表达特性

以组成型表达的OsActin1为内参基因，通过荧光定量PCR检测OsMPK15在幼穗期水稻根、茎、叶、叶鞘以及不同发育阶段幼穗组织中的相对表达水平。结果（图4）显示，OsMPK15在水稻幼穗期所检测的各组织中普遍表达，但表达水平存在差异。其中在叶和叶鞘中的表达量显著高于在其他组织中的表达量，是其他组织中表达量的4-6倍。

2.4 激素对OsMPK15在幼苗根中表达的影响

以JA、SA和ABA分别处理15 d的水稻幼苗，以水稻OsActin1作为内参基因，采用qRT-PCR技术检测OsMPK15在3种激素处理后的根中24 h之内的表达变化。结果（图5）显示，OsMPK15对3种激素均有应答，在检测的24 h内，均出现表达水平上调，而后恢复的趋势，但是表达峰值出现的时间不同，其中JA处理12 h后其表达上调了4倍，SA处理3 h后表达上调了4倍，ABA处理9 h后其表达上调了7倍，提示该基因对这些激素的敏感度和应答模式存在差异。

图4 OsMPK15在水稻幼穗期各组织中的表达

2.5 非生物胁迫对OsMPK15基因表达的影响

对水稻幼苗进行模拟干旱和高盐处理，采用实时荧光PCR检测该基因在根中24 h之内的表达变化，发现在模拟干旱的胁迫下，OsMPK15的表达量出现明显上调，在处理的12 h内其表达量维持在0 h的3倍左右，随后呈现下降趋势；在高盐处理条件下，其表达量也有上调，在9 h内表达量逐渐上升，达到2倍后呈现下降趋势（图6）。结果表明，干旱和高盐对OsMPK15的表达都有影响，但是相比之下，干旱对该基因表达的影响更为显著。

图5 JA、SA和ABA激素处理对OsMPK15基因表达的影响

图6 干旱和盐胁迫对OsMPK15表达的影响

3 讨论

无论酵母还是动植物的MAPK在进化过程中都高度保守，具有相似的保守结构。与动物的细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）相似，植物MAPK活性环上同样具有TDY或TEY基序［21］。同样，依据活性环上特殊基序TXY的种类（TEY/TDY），将水稻MAPK划分为A-F 7组，本研究通过RT-PCR技术克隆的OsMPK15序列与文献推测的序列［22］一致，预期编码的蛋白包含498个氨基酸，属于E组成员。与之同属E组的OsMPK13已被证实参与苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTH）诱导的水稻抗病反应［23］，OsMPK14在水稻的非生物胁迫与激素应答调控过程中具有重要作用［22］，但对OsMPK15的研究尚未见报道。

不良的土壤条件如干旱、高盐等是制约水稻产量的主要因素。已有研究显示，MAPK在植物应答多种非生物胁迫的过程中扮演了重要的角色。例如，在拟南芥中，低温、高盐、机械损伤等可以显著提高AtMEKK1的转录水平［24］；低温、干旱、高渗、创伤等可以激活AtMPK4和AtMPK6的瞬时表达［25］。水 稻 中 OsMPK4、OsMPK5、OsMPK7、OsMPK8和OsMPK12等都可以被干旱、盐或者温度的变化而诱导表达［26-28］。为了研究非生物胁迫对水稻OsMPK15基因表达的影响，本研究模拟了干旱和高盐胁迫，并利用实时荧光定量PCR技术进行了检测。发现在干旱和盐胁迫下，OsMPK15在根中的表达量均出现上调。相对于盐胁迫，OsMPK15对干旱胁迫更敏感。有报道显示，与OsMPK15同源性极高的OsMPK14和小麦TaMPK2均参与了非生物胁迫和激素的应答调控过程［22］。已有研究显示，外源ABA影响了多种植物MAPK基因的表达、蛋白的积累以及酶的活性，MAPK还参与了ABA介导的多种信号通路，包括氧化防御、保卫细胞信号转导和种子的萌发［29-32］。在拟南芥中，JA和SA可以诱导AtMPK6和AtMPK3的表达［33-34］。本研究发现，OsMPK15对激素ABA、JA和SA均有响应，其中以ABA诱导OsMPK15表达上调幅度最大。鉴于ABA是植物逆境胁迫相关激素，OsMPK15对ABA处理产生高度的应答反应，同样暗示该基因可能参与了水稻的逆境胁迫应答过程。本研究还发现，OsMPK15的表达与实验室前期报道的OsMPK14基因的表达模式十分相似，但也存在显著差异，如OsMPK14的表达在一定程度上受到干旱胁迫的抑制作用［18］，这些结果说明这两种水稻MAPK与水稻的非生物胁迫应答有密切联系。此外，OsMPK15在幼穗期的水稻各组织中在叶和叶鞘中优势表达，OsMPK14在水稻地上部分的表达受到光的负调控［18］，提示它们也可能与水稻的光信号通路存在关联，值得进一步的深入研究。

本研究结果提示，水稻OsMPK15可能与水稻的非生物胁迫应答、激素信号通路以及光信号通路有所关联，但其具体功能尚未见报道，应答机制也有待研究。目前，实验室已通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建了OsMPK15敲除水稻，后续将开展对OsMPK15与水稻非生物胁迫应答、激素应答、光信号通路关系的研究，以期对其功能开展进一步的分析鉴定，为揭示其在体内的作用机制提供理论依据。

4 结论

克隆了水稻OsMPK15的cDNA编码区，发现该基因在不同组织中表达存在差异，能够被ABA、SA、JA高度诱导，同时受干旱和盐胁迫影响，推测该基因可能与水稻的抗逆应答过程密切相关。

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