石斛属植物茎部总RNA提取方法的研究

单婷婷 陈晓梅 郭顺星 王倩清 王爱荣

（1. 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2. 鲁东大学农学院，烟台264025）

全世界约有兰科石斛属（Dendrobium）植物1 500多种［1］，我国有74种2变种，其中51种可作药用［2］。我国2015版药典规定，中药铁皮石斛的来源植物为铁皮石斛（D. officinale Kimura et Migor），中药石斛的来源植物包括金钗石斛（D. nobile Lindl）等多种同属近似种［3］，药材的药用部位均为植物的新鲜或干燥茎［4］。石斛属植物茎多糖含量普遍较高，其中铁皮石斛茎多糖被认为是药材的主要有效成分。

高质量RNA是开展cDNA文库构建、荧光定量PCR检测、Northern杂交等分子生物学研究的必要前提［5］。对于富含多糖的植物组织，传统的RNA提取方法是经过SDS-盐酸胍处理去除多糖，或是在高浓度Na+或K+存在条件下，利用苯酚、氯仿抽提去除多糖，最后都通过LiCl沉淀RNA［6］。传统方法存在多糖去除不完全［7］，LiCl沉淀导致RNA丢失，提取效率低，耗时长等缺点［8］。目前多用试剂盒方法提取RNA。试剂盒法主要是利用异硫氰酸胍去除多糖。异硫氰酸胍是强烈的蛋白质变性剂，不仅能有效解离核蛋白和核酸的复合体，还能抑制RNA酶的活性［9］，且不易发生RNA丢失。与传统方法相比，试剂盒法还具有操作简单，重复性好等优点［10］。

植物的不同组织和器官，由于化学成分组成的差异，导致提取RNA的方法有很大差别［11］。根据文献报道，铁皮石斛茎中次生代谢关键酶基因表达量最高［12-14］，但是铁皮石斛RNA提取方法研究中使用的材料多为叶片，鲜有关于茎RNA提取方法的报道［15-18］。目前铁皮石斛依赖人工栽培生产药材，采收生长2-3年的茎入药，这个阶段多糖含量最高，通常可达20%-30%［19］；叶和根的多糖含量分别为10%-14%和8%-10%［20］。鉴于此，本研究以多糖含量高的2年生铁皮石斛茎为实验材料，研究建立总RNA提取的试剂盒方法，以期为石斛属植物茎的分子生物学研究奠定基础，并为其他富含多糖的植物器官的RNA提取提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

用于方法学研究的铁皮石斛样品，采自江苏省泰州市江苏益草堂石斛股份有限公司（以下称为益草堂公司），为该公司生产的组培苗移栽种植大棚后生长两年的茎杆。干燥茎多糖含量29.5%。每种RNA提取方法采集3份样品，作为生物学重复。

铁皮石斛样品均来自益草堂公司生产的组培苗，生长条件和生长时间分别是：中国科学医学院药用植物研究所温室种植1年（W），益草堂公司种植大棚生长3个月（S）、1年（Y）和2年（L）。金钗石斛（J）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum Lindl，G）、球花石斛（D. thyrsiflorum Rchb. f.，Q）和重唇石斛（D.hercoglossum Rchb. f.，C）均在药用植物研究所温室生长两年以上。W与Y用于比较不同生长条件的铁皮石斛，S、Y和L用于比较不同生长时间的铁皮石斛，L、J、G、Q和C用于比较不同种石斛属植物。以上每个样品采集3份，作为生物学重复。

以上植物均经过中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员鉴定。将新鲜石斛茎切段，迅速放入液氮中速冻，后置于-80℃保存，备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取方法 研究共采用了7种RNA提取方法：TRIZOL法 +去多 糖辅助剂（M1）［17］、QIAGEN试剂盒法（M2）［21］、百泰克通用试剂盒法（M3）［17］、百泰克多糖多酚试剂盒法（M4）［22］、艾德莱多糖多酚试剂盒法（M5）［23］和华越洋多糖多酚试剂盒法（M6）［24］和改良华越洋多糖多酚试剂盒法（M7）。前6种方法均按照试剂盒附带的操作步骤提取RNA。M7在试剂盒操作步骤的基础上进行了2方面的改良：加大样品量；延长孵育时间。

改良华越洋多糖多酚试剂盒法（M7）提取RNA过程如下：（1）称取300 mg铁皮石斛茎段，液氮充分研磨后加入3 000 μL细胞裂解液混匀，50℃孵育10 min；（2）所得混合物的液体部分转移至离心管，加入900 μL去蛋白液和600 μL氯仿，震荡混匀，静置2 min，离心10 min；（3）上清液加入等体积漂洗液，颠倒混匀，混合物通过离心吸附柱，离心1 min，弃废液；（4）用洗柱液清洗吸附柱2次，每次清洗后离心1 min，弃废液；（5）取45 μL DNase buffer和 5 μL RNAse free DNase I混合均匀，37℃预热1 min，加入吸附柱，静置5 min；（6）用去酶液清洗吸附柱2次，每次清洗后离心1 min，弃废液；（7）吸附柱加30-80 μL RNA洗脱液，静置3-5 min，离心1 min，收集RNA溶液。以上操作均在室温下进行，离心速度均为12 000 r/min。

1.2.2 RNA质量检测 RNA浓度及纯度用NanoDropTM2000分光光度计（Thermo Fisher，USA）检测［25］，1.0 μL总RNA上样，平行检测5次，记录总RNA浓度、OD260/OD280，计算平均值。RNA纯度要求：1.8≤OD260/OD280≤2.2。RNA完整性用凝胶电泳检测［26］，0.5×TBE Buffer电泳缓冲液，3 μL RNA 混入 0.6 μL 6×Loading Buffer（TaKaRa）点样，1.0%琼脂糖（Biowest® Regular Agarose G-10）凝胶，200 V电泳15 min。

1.2.3 M7的方法验证 用M7方法对各样品茎RNA进行提取，并检测RNA质量。

1.2.4 统计方法 对M2-M7的RNA浓度和纯度测定值用SPSS软件进行单因素方差分析，比较不同方法提取的茎总RNA的质量差异。由于方差不齐，用Dunnett’s T3进行多重比较。

2 结果

2.1 七种方法提取RNA过程中的现象

七种提取RNA的方法，除了M1需要用异丙醇沉淀并自然干燥RNA，其他6种都是用吸附柱收集RNA的试剂盒法。选取上柱前实验过程中现象变化最明显的3个阶段进行观察，它们分别是：加入裂解液后、水浴离心后和加入氯仿后。

M2、M3和M4在加入裂解液后溶液比较黏稠（图1-A）。水浴离心后7种方法都会出现沉淀（图1-B），其中M2出现了白色絮状沉淀；M3和M4水浴离心后上清液仍较黏稠，不易吸取；氯仿的作用是将RNA与DNA和蛋白质分离，进入水相。加入氯仿后溶液分为3层：上层为含有RNA的水相；中层为DNA、蛋白质和其他杂质；下层为有机相（图1-C）。这个阶段M4上层为黏稠的白色液体，M3实验过程中没有加入氯仿，分层出现在加入70%乙醇后，上清为黏稠的透明液体。由于水浴离心后已经将M2和M5上清液转移到过滤清除柱中，因此在这个阶段M2和M5无明显分层现象。

2.2 七种方法提取的总RNA的质量检测

2.2.1 RNA完整性 图2为1.0%琼脂糖凝胶电泳图，M1、M2和M3方法没有rRNA条带，M4和M5方法rRNA条带不清晰，M6和M7方法有较整齐、清晰的28S和18S rRNA条带。

2.2.2 RNA浓度和纯度 测定结果见表1。M1总RNA浓度异常高，紫外检测有两个吸收峰，表明样品中掺杂有DNA，测定值不可靠，因此不参与统计。M2-M7数据的单因素方差分析结果表明，不同提取方法的总RNA浓度有显著性差异（P＜0.05），纯度没有显著性差异（P＞0.05）。经Dunnett’s T3多重比较，M7与M2和M3的总RNA浓度有显著性差异（P＜0.05）。M7总RNA浓度最高，为139.13±22.02 ng/μL，浓度变异系数（C.V）最低，为15.83%，总RNA纯度最高，OD260/OD280为2.12±0.01，表明该方法稳定，重复性好，提取获得的总RNA质量符合分子生物技术要求。M7总RNA浓度较M6提高了98.6%，纯度提高了79.7%，改良效果明显。

图1 七种方法提取RNA过程中的现象

图2 七种方法提取铁皮石斛茎总RNA的电泳图

表1 七种方法提取铁皮石斛茎总RNA的浓度和纯度（n=3）

2.3 M7方法验证

2.3.1 RNA完整性 经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，M7提取的不同生长条件（W和Y）和不同生长时间（S、Y和L）铁皮石斛，以及不同种石斛属植物（L、J、G、Q和C），均有整齐、清晰的28S和18S rRNA条带（图3）。

2.3.2 RNA浓度和纯度 M7提取的W、S、Y和L的铁皮石斛茎总RNA浓度在50 ng/μL-140 ng/μL之间，OD260/OD280在1.8-2.2之间。M7提取的J、G、Q 和 C茎总 RNA 浓度在 60 ng/μL-110 ng/μL之间，OD260/OD280在2.0-2.1之间（表2）。以上结果均能满足下游的分子生物学实验要求。

图3 M7方法验证的茎总RNA电泳图

3 讨论

RNA提取的原理是首先将细胞破碎裂解，利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和DNA的污染，再通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终获得纯净的RNA［27］。富含多糖的植物组织，由于细胞破碎后多糖常与RNA形成难溶性物质，导致RNA分离困难，并造成初提时上清液黏稠，不能很好的与有机相分离，在去除多糖的同时造成RNA大量丢失，降低RNA得率［28］。因此，更高效的细胞裂解是从这类组织中获得高质量及高产量RNA的前提。

表2 M7方法验证的茎总RNA（n=3）

裂解细胞的方法分为物理方法（液氮研磨破碎法）、生物方法（酶方法：蛋白酶K、溶菌酶）和化学方法（CTAB、SDS、NaI、KI、蛋白质变性剂）。本研究所采取的7种方法，M1、M2、M4和M5主要是利用异硫氰酸胍变性剂来破碎细胞壁和去除RNA酶［29］，M3和M6所使用的裂解液试剂公司保密。M1、M2和M3为通用试剂盒。李清等［21］报道用M2提取金钗石斛茎RNA可获得满意的结果。用M3提取铁皮石斛［17］、福建山樱花［30］、草珊瑚［31］等植物材料的RNA均出现DNA污染、RNA完整性差的现象。本研究结果与这些文献的报道一致。M4、M5和M6为多糖多酚试剂盒。据报道，M6多用于提取富含多糖多酚类植物的RNA。如甘薯［24］、番茄［32］、芒果等［33］，提取结果能满足进一步实验的要求。M7在M6的基础上采取延长孵育时间和加大样品量的措施。延长孵育时间可以增加裂解液与细胞的接触，使其充分裂解，彻底释放RNA［23］。由于石斛属植物富含多糖，在加入裂解液之后会产生大量沉淀，上清液体积小，不易吸取。加大样品量可以获得足够的上清液，减少蛋白质等的污染。采取以上改良措施后，M7达到了去除杂质污染和提高RNA浓度的目的，获得了比M6更好的实验结果。

4 结论

改良华越洋多糖多酚试剂盒法（M7）既能有效去除多糖，也能满足后续分子生物研究对RNA质量的要求，可用于提取石斛属植物茎RNA，也可为富含酚类和多糖等物质的其他植物材料的RNA提取提供参考。

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