atRA对大鼠结肠炎中TGF-β1/Smad3通路的作用研究

苏玉清，王 烜

0 引言

过度激活的免疫炎症反应与抗免疫炎症反应之间的失衡，是导致炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)炎症持续存在的重要机制之一[1]。机体中这种对抗过强的炎症反应主要通过TGF-β1/Smad3通路实现[2]。但IBD中，该通路受损[3]：即IBD患者体内TGF-β1较正常人升高，但由于高表达的Smad7蛋白抑制了该通路中的Smad3磷酸化为pSmad3，使得TGF-β1不能正常发挥其免疫抑制作用，导致炎症持续存在[4-5]，修复该通路，理论上即可达到缓解结肠炎症状的目的。

全反式维甲酸能够在炎症状态下维持TGF-β1对Treg形成的诱导，防止其向Th17转化；同时维持Foxp3的持续表达[6]，而Treg是IBD中起免疫抑制的重要细胞之一。atRA与TGF-β1在Treg细胞的特异性转化因子Foxp3的生成上有协同作用[7]。atRA可增加Smad3基因的表达。在体外模拟的炎症状态下，全反式维甲酸单独干预仅能诱导Smad3 mRNA的转录，但不改变pSmad3的含量，但加入TGF-β1，可增加pSmad3的含量[8]。因此，鉴于免疫-抗免疫失衡在IBD中的重要作用，本实验就atRA是否能通过修复TGF-β1/Smad3信号通路，达到缓解结肠炎症状的目的，进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠购自西南医科大学实验动物中心，雄性，体重(220±20)g。

1.2 主要实验器材及试剂 三硝基苯磺酸(5%TNBS)(美国Sigma公司)；全反式维甲酸片(山东来福制药有限公司)，美沙拉嗪(法国爱的发制药集团)，无水乙醇、异丙醇(国药集团)；IL-17 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒(北京诚林生物有限公司)；Smad7兔抗鼠多克隆抗体(北京博奥森有限公司)；pSmad3兔抗鼠多克隆抗体(Bioworld)；PCR仪(杭州博日科技)；免疫组化染色仪(美国Ventana公司)；全自动酶标仪(芬兰Thermo公司)。

1.3 方法 实验动物编号后，用随机数字表法分为5组：对照组(C组)，造模组(TNBS组)，美沙拉嗪组(M组)，全反式维甲酸组(A组)，全反式维甲酸+美沙拉嗪组(MA组)，适应性饲养1周，予TNBS/无水乙醇灌肠液(100 mg/kg)造模。24 h后，予不同药物灌胃：①C组及TNBS组(2 mL生理盐水)；③M组(30 mg/kg)；④A组(20 mg/kg)；⑤MA组(为上述二者的联合)。

2 固定、取材、测指标

2.1 取材 于造模后每天行DAI积分(参照Osman N等标准)：①体重：不下降或升高计0分，下降1%～5%计1分，下降6%～10%计2分，11%～15%计3分，>15%计4分；②大便：正常计0分，半稀便计2分，稀便计4分；③隐血：阴性计0分，阳性计2分，出现肉眼血便计4分。8 d后，心脏负压采血5 mL，提取血清储存，待用ELISA法检测用。处死大鼠，肉眼观察结肠大体观。取病变明显的结肠组织行病理切片及免疫组化实验及QT-PCR实验。

2.2 相关指标的检测

2.2.1 HE染色及切片观察 结肠组织经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、透明，封片，观察病理改变，行TDI评分。0分：没有损伤；1分：较弱的黏膜和黏膜下炎症浸润和充血水肿，黏膜轻度糜烂，而黏膜肌层保持完整；2分：在1分的基础上，范围达标本的50%以上；3分：显著的炎症浸润和充血水肿，溃疡延伸到黏膜下层和黏膜肌层，较少的炎症细胞浸润固有层，无肌层坏死；4分：在3分的基础上，范围达标本的50%及以上；5分：广泛的溃疡形成，伴有坏死，细胞坏死达黏膜固有肌层；6分：在5分的基础上，范围达标本的50%及以上。

2.2.2 免疫组化测定Smad7、pSmad3水平 组织脱蜡、水化，封闭，滴加羊抗大鼠Smad7、pSmad3多克隆抗体，滴加生物素化的兔抗羊抗体室温孵育，DAB显色，蒸馏水终止反应，显微镜高倍镜下(×400)随机选取5个视野，在相同条件下拍摄并用Image-proplus(IPP)6.0图像分析软件测定积分光密度(Integrated option density，IOD)。

2.2.3 ELISA检测IL-17、TNF-α水平 按ELISA试剂盒进行试验，测定各孔的吸光度(OD值)。绘制标准曲线，计算多项式二次回归方程，计算样品的实际浓度。

2.2.4 QT-PCR检测TGF-β1、Smad7水平 取约100 mg组织，按RNA提取试剂盒提取RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒测定mRNA，反应程序：95 ℃预变性1 min,95 ℃循环(40次),溶解曲线60 ℃→95 ℃，每20 s升温1 ℃;反应体系为：2×qPCR Mix 5.0 μL,引物工作液1.0 μL,Template 1.0 μL,ddH2O 2.8 μL,Rox 0.2 μL(引物见表1)。

3 结果

3.1 模型建立及一般形态观察 造模后所有大鼠均出现水样、糊状稀便，以及精神萎靡，懒动，进食少，毛色脏乱，对刺激反应迟钝，造模后第2、3天，个别大鼠解鲜红色血便。予以干预后，在造模后第4天M组和MA组大鼠粪便好转，A组在造模后第5天出现粪便好转。至实验结束(即造模后第8天)，模型组死亡大鼠2只，其中1只解剖后考虑肠坏死；另1只考虑炎症过重导致。M组及A组各死亡1只，前者推测为灌胃时药物误入气管导致窒息，后者则是炎症过重所致。C组无大鼠死亡，毛色光亮，体重增加(见图1)。

3.2 结肠大体观 C组无充血、水肿、狭窄，肠壁蠕动好，与周围组织无黏连。模型组大鼠结肠局部严重狭窄、僵硬，肠段缩短，肠段可见多个散在表面附有脏苔之溃疡面，周围黏膜充血、水肿、糜烂，与周围组织严重黏连，无法分离。M组及A组大鼠结肠局部有黏连、轻度狭窄，但肠蠕动可，未见明显深凹溃疡面。MA组结肠局部黏连轻，肠段长度基本正常，肠壁蠕动好(见图2)。

3.3 大鼠的DAI积分及体重分析 药物干预后，各组体重比较差异有统计学意义(F=21.85，P<0.05)；组间比较提示，TNBS组下降最显著，相较于其他各组差异有统计学意义(P<0.01),A组与M组比较差异无统计学意义(P=0.589),MA组较A组和M组升高(P=0.006、0.02)。DAI积分显示，药物干预后，DAI评分较前明显好转，其中仍以TNBS组评分最高，各组间DAI积分比较差异有统计学意义(F=67.7,P<0.05)；A组与M组相比，DAI积分差异无统计学意义(P=0.585)，MA组与A组和M组比较差异有统计学意义(P=0.005、0.019)。提示药物干预缓解了大鼠结肠炎症状，以MA组效果最明显。见表2、图3。

3.4 大鼠结肠组织病理学观察 大鼠结肠组织行HE染色后10×10倍显微镜下观察，可见C组各层结构清晰，无溃疡形成，腺体排列有序，固有层可见少许炎症细胞。TNBS组可见大量中性粒细胞等炎症细胞浸润结肠全层，各层结构及腺体等消失，无法辨认，溃疡深达肌层。干预后，A组较M组黏膜下层仍有较多炎症细胞浸润，但可见修复的黏膜层及杯状细胞，部分黏膜仍可见浅小溃疡，各层结构基本能辨认。MA组各层结构可辨识，仍可见到炎症细胞浸润，个别腺体排列欠规则，黏膜层基本修复，未见明显溃疡面形成。结肠组织病理学评分提示，各组差异有统计学意义(F=26.25，P<0.01)；组间比较，相较于TNBS组，经处理后，各组病理评分均有所好转(P<0.01)，M组与A组比较差异无统计学意义(2.86±0.69 vs. 3.14±1.34，P>0.05),MA组缓解最明显，相较于M组、A组，差异有统计学意义(P=0.002、0.009)。见表2、图4。

表1 引物(由Invitrogen Biotechnology Co,LTD中国公司合成)

图1 大鼠一般情况

表2 各组大鼠DAI积分、体重及TDI评分比较

组别处死当日DAI积分处死当日体重(g)TDIC组0.00±0.00240.90±7.380.25±0.46TNBS组8.33±1.21*193.82±14.52△4.67±1.03△A组3.29±1.11*209.60±10.87#△2.86±0.69#△M组3.00±1.29*212.53±9.92#△3.14±1.34#△MA组1.71±0.75*225.53±6.89#1.57±0.53#F值67.7821.8526.25P值<0.01<0.01<0.01

注：*与C组比较，P<0.05；#与TNBS组比较，P<0.05；△与MA组比较，P<0.05

3.5 结肠组织QT-PCR检测TGF-β1及Smad7 mRNA的表达 各组TGF-β1 mRNA比较差异有统计学意义(F=1 421.25，P<0.01),其中TNBS组较C组有所升高(P<0.01)，A组较M组、MA组TGF-β1 mRNA升高更明显，联合组为甚，A组与M组比较差异无统计学意义(P=0.427),联合组较单药组升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。多组组间分析提示，各组Smad7 mRNA比较差异有统计学意义(F=242.25,P<0.01),TNBS组中表达最高，C组最低，差异有统计学意义(P<0.01)。干预后，相较于TNBS组，其他组Smad7 mRNA表达均下降，以联合组下降最明显(P<0.01)，A组与M组比较差异无统计学意义(P=0.586)。提示TNBS组虽然较C组TGF-β1表达增加，但其肠道仍然有很严重的炎症损害，提示在TNBS组中增加的TGF-β1并不能完全发挥其正常的免疫抑制效应从而减轻炎症。而在结肠炎模型组中，Smad7的转录水平较其他组均明显升高，表明可能是过度表达的Smad7抑制了TGF-β1的这种保护效应。见表3。

图3 大鼠结肠DAI及TDI直方图

图4 大鼠结肠组织病理切片(HE，100×)

表3 各组大鼠TGF-β1/Smad3通路蛋白mRNA水平比较

注：*与MA组比较，P<0.05；#与TNBS组比较，P<0.05

3.6 ELISA法检测血清中的IL-17、TNF-α水平 多组组间分析提示各组IL-17比较差异有统计学意义(F=85.94，P<0.01),以TNBS组最高，差异有统计学意义(P<0.01)，C组最低。干预后，各药物组较TNBS组均有明显下降(P<0.01)，相较于A组和M组，MA组下降最明显(P=0.008、0.022)。各组间TNF-α比较差异有统计学意义(F=74.13，P<0.01)，以TNBS组最高，差异有统计学意义(P<0.01)，C组最低(P<0.01)，MA组下降最明显(相较于A组及M组，P=0.001、0.002)。提示，经药物干预后，各组炎症较TNBS组有缓解，MA组效果明显，但仍未达C组水平。见表4。

3.7 免疫组织化学检测Smad7、pSmad3蛋白的表达 免疫组织化学方法提示，这2种蛋白主要表达于固有层免疫细胞，胞质和部分细胞核表现为棕黄色为阳性细胞。IPP-6测定IOD，Smad7在TNBS组表达最高，差异有统计学意义(P<0.01)；干预后，各组均有所下降，以MA组下降最明显。多组组间pSmad3蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F=273.39，P<0.01)；两两比较提示，相较于其他各组，C组表达最高(P<0.01)，A组与M组pSmad3表达差异无统计学意义(P=0.397)，MA组较A组和M组升高(P<0.01)，TNBS组积分光密度值最低。见表5、图5～图7。

表4 各组血清炎症因子水平比较

注：*与MA组比较，P<0.05；#与TNBS组比较，P<0.05

表5 各组大鼠Smad7、pSmad3蛋白IOD值比较

注：*与MA组比较，P<0.05；#与TNBS组比较，P<0.05

图5 大鼠结肠组织中Smad7、pSmad3蛋白IOD直方图

3 讨论

炎症性肠病的发病原因尚不完全清楚,在发病过程中，多种炎症通路(NF-κB通路、MAPKs通路等)的激活，以及多种致病性免疫细胞(Th1细胞、Th17细胞等)的活化，释放出大量炎症因子，如IL-17、TNF-α、IL-6、IL-23等，引发肠道黏膜损伤，导致一系列临床症状如腹痛、黏液血便等的出现[9-10]。对于一般的免疫炎症反应，机体存在保护性的对抗机制，即抗免疫炎症反应，目的是减少过度激活的炎症反应持续存在造成组织损伤，但是在IBD中，这种对抗机制被削弱。因此，增强或恢复机体本身存在的抗免疫炎症反应可成为一种新的治疗途径。在炎症性肠病中，这种抑制作用主要通过TGF-β1/Smad3通路来实现，TGF-β1与TβRⅠ-TβRⅡ异二聚体结合，活化TβRⅠ，后者吸引Smad2/Smad3结合并将其磷酸化，活化的pSmad2/Smad3与Smad4结合,共同入核，启动下游目的基因的转录，发挥免疫抑制效能。Smad7通过作用于TβRⅠ从而阻断Smad2/Smad3磷酸化而活化，最终遏制该通路下游基因的转导[3]。在炎症性肠病中，过度表达的Smad7阻断了该通路的正常转导，导致抗炎因子生成减少，从而使得过度激活的炎症反应失去控制。

图6 大鼠结肠组织中Smad7蛋白(免疫组化，400×)

图7 大鼠结肠组织中Smad3蛋白(免疫组化，400×)

在本实验中，TNBS组TGF-β1高于C组，TGF-β1是体内免疫抑制作用最强的因子，但是在如此高表达水平下，TNBS组仍出现不可控的炎症反应，说明TNBS组大鼠体内的TGF-β1并没有完全发挥其免疫抑制作用。随后，我们研究了TGF-β1最重要的通路TGF-β1/Smad3；QT-PCR结果显示，C组的Smad7 mRNA较TNBS组下降。进一步采用免疫组织化学检测了Smad7、pSmad3的表达，结果提示，C组Smad7远低于模型组，而pSmad3远高于TNBS组，提示TNBS结肠炎模型中存在TGF-β1/Smad3的受损。这与之前的研究结果一致[3]。

经全反式维甲酸干预后，与TNBS组比较，在症状、病理等方面均得到改善，提示全反式维甲酸对结肠炎有治疗作用。进一步的结果提示，与TNBS组比较，QT-PCR显示，全反式维甲酸可以抑制Smad mRNA水平，免疫组织化学结果提示，Smad7蛋白在atRA组明显减少，这种减少可能是通过基因转录层面实现的。Smad7的减少间接引发pSmad3的表达量显著上调，这提示全反式维甲酸可能通过修复TGF-β1/Smad3通路发挥缓解作用。进一步检测该通路下游的炎症因子水平也支持这种推测。

将A组与目前用于治疗炎症性肠病的一线药物美沙拉嗪比较，两者的治疗效果大体相似，包括DAI、结肠大体外观及TDI积分在内的统计结果，TGF-β1/Smad3通路的蛋白转录和表达水平，以及该通路下游的炎症因子的浓度，两者差异均无统计学意义。但是Rousseaux等[11]已经证实，美沙拉嗪是已经明确了的PPARγ新型配体，其作用靶点并不是TGF-β1/Smad3通路。因此，推测出现这种结果的原因可能是：TGF-β1/Smad3通路中的Smad蛋白(包括Smad7和Smad3在内)作为体内多种炎症通路(JNK通路、NF-κB通路等)的交汇点，通过其可以影响各炎症通路的表达水平，各炎症通路也可以反过来调节TGF-β1/Smad3通路，包括上调或下调Smad蛋白表达量[12]。因此，美沙拉嗪作用于PPARγ-NF-κB通路，使得炎症反应减轻，下调了Smad7蛋白的表达。

与单用药组比较，MA组的治疗效果更好。MA组Smad7 mRNA、Smad7蛋白的表达明显少于单一用药组，而pSmad3则较高。既往研究证明，美沙拉嗪的作用靶点是PPARγ。PPARγ被配体激活后,必须先与视黄酸X受体α(RXRα)结合形成PPARγ/RXRα异二聚体,然后才能与靶基因的特异性DNA序列结合，激活并介导靶基因转录。atRA拥有与9-cis-RA相似的RXRα激活特性，PPARγ配体(美沙拉嗪)和RXRα配体(atRA)的双重激活能使异二聚体发挥更强的转录因子活性[13-14]。因此，联合使用美沙拉嗪+全反式维甲酸这两种作用靶点不同但又具有协同作用的药物，可能是治疗效果更好的原因。

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