细胞内单域抗体的研究及应用进展

潘永刚，刘晓志，高 健，王志明

0 引言

在蛋白质功能研究中，DNA敲除和mRNA敲低方法是必不可少的研究手段。蛋白质抑制剂是蛋白质翻译后修饰、构象和相互作用区域研究的有益补充[1]。蛋白质抑制剂包括肽、变构调节剂、短单链DNA或RNA寡核苷酸(Aptamers，Intramers)、中和抗体、胞内抗体和非免疫球蛋白支架抗体(如：cysteine-Knot Proteins、Adnectins、Anticalins、Affibodies和DARPins等)。

细胞内抗体，即靶向细胞内抗原的抗体分子，是重组的抗体片段，主要优点是特异性高，靶向翻译后修饰，相互作用区域，构象异构体，剪接变体和同种型，没有脱靶效应。不同于经典的中和抗体，细胞内抗体可以实现对细胞内蛋白质功能的长效抑制，可以被特异性地转运到细胞质，细胞核或内质网的特定区域，并与相应的抗原结合[2]。

细胞内抗体发展的问题：scFv和Fab型的细胞内抗体不能在细胞质的还原环境内形成二硫键，因此，其结构稳定性差。

酵母双杂交系统中表达的功能性scFv型细胞内抗体的研究策略，使一些功能性scFv型的胞内抗体被发现[3]。在抗体工程研究中，研究者发现了稳定型的sdAb(Single domain antibody)型细胞内抗体，这些抗体来自骆驼或鲨鱼，但是仅包含抗体的重链可变区。VHH是来自骆驼的重链抗体，识别新抗原受体(IgNAR，New antigen receptor)的抗体来自鲨鱼的可变区，称为vNAR。来自骆驼的VHH称为纳米抗体(Nanobodies)。

来自骆驼或鲨鱼的单域抗体均具有完整的功能性抗原结合位点，VHH单域抗体具有3个互补决定的CDR (Complementarity determining regions)区，vNAR单域抗体包括CDR1、CDR3、HV2和HV4。骆驼和鲨鱼的单域抗体具有良好的溶解性、热稳定性和复性能力。此外，通过构架区的突变和CDRs随机改造，可以增加人源VH和VL单域抗体的稳定性。即使没有形成二硫键，骆驼源抗体也可以在细胞质中稳定表达。折叠后的纳米抗体可以找到抗原，并和抗原稳定结合[4]。

纳米抗体被用于体内分子运输过程、蛋白质构象检测和翻译后修饰的研究。此外，当不稳定蛋白质对降解、展开或聚集敏感时，纳米抗体也作为结晶分子伴侣使用。

抗体片段一般通过噬菌体或酵母进行展示，然后通过筛选sdAbs抗体、单克隆化等步骤，最终得到细胞内抗体。通用合成抗体库进行纳米抗体的筛选不需要用抗原进行动物免疫，因此较为快捷。低亲和力抗体可以通过CDR突变、热点随机化突变或容错PCR实现亲和力成熟。目前，纳米抗体数目不断增长，其中大多数来源于骆驼，一些来源于人源VH和VL的结构域。此类靶点包括：包括激酶的胞内酶、致癌蛋白、毒素、神经系统的蛋白质、病毒蛋白、植物和果蝇蛋白等[5]。

大多数sdAbs已经在活细胞中进行了评估，其中一部分进行了动物实验。在一些研究中，基因敲除对实验动物是致命的，而使用表达细胞内sdAb转基因小鼠可以进行替代。

ER (Endoplasmic reticulum，内质网)胞内抗体的功能敲除是通过胞内抗体C末端与KDEL序列结合，滞留分泌途径上相关分子来实现[6]。ER-胞内抗体可以在ER环境中进行正确折叠[7]，因而曾被认为是最有希望的蛋白抑制剂。与ER-胞内抗原结合相反，胞内抗体必须通过与抗原结合并诱导构象改变，或干扰靶蛋白与其特异性结合伴侣分子，而实现蛋白功能的抑制。靶向ER(ER-胞内抗体)的内抗体主要是scFv片段，胞质/胞内抗体是scFv片段更稳定的单域抗体。由于sdAb在细胞质/细胞核中的高稳定性，基于噬菌体和酵母筛选的高特异性，对胞质/核蛋白功能抑制的sdAb具备良好的开发和研究前景。

1 细胞质/细胞核内抗体

为了获得稳定正确折叠的scFv片段，必须使用酵母、大肠杆菌等系统进行特异性抗体的筛选，其他可能的选择包括，表达scFv-蛋白融合CDR，或将合成的CDR引入稳定的抗体框架上[8]。基于酵母双杂交系统的抗体捕获技术(Antibody Capture Technology，IACT)是筛选功能性scFv的最常用的方法。

1.1 ScFv型抗体 IACT技术筛选得到了许多不同的scFv，如：针对Tau蛋白、淀粉样蛋白-β肽、α-突触核蛋白、proNGF、gephyrin、Syk、EGFR、BCR-ABL、半胱天冬酶3、聚集蛋白聚糖酶-2和轮状病毒NSP5蛋白。

最近，研究者应用IACT技术筛选到针对HPV病毒 E6癌蛋白的scFv片段，该片段到达细胞核并抑制HPV16E6(16E6)活性，诱导p53降解，引发HPV16阳性细胞凋亡。此外，在2项小鼠实验中，靶向细胞核的细胞内抗体抑制了HPV16阳性肿瘤细胞的肿瘤活性。另外，构建的2种双特异性scFv片段，第1种同时具有靶向细胞核转运和恢复突变p53功能，第2种同时具有靶向细胞核转运和结合Mdm2，防止p53被Mdm2降解[9]。上述3种scFv片段均由相应杂交瘤克隆获得。

1.2 单域抗体 与繁琐耗时的scFv′s筛选不同，单域抗体可通过免疫、天然、合成文库、有噬菌体或酵母展示技术进行快速抗体筛选。单域抗体仅由1个V区(重链或轻链可变区)组成，其可以在细胞质或细胞核内稳定表达。

2 细胞质/细胞核单域胞内抗体

从骆驼科重链IgG(VHHs)、软骨鱼IgNAR(VNA)或常规人IgG(VH和VL)可以获得单域抗体。上述抗体可以由骆驼或鲨鱼的免疫库、天然库或由具有稳定支架的合成库中筛选得到。然而，针对免疫骆驼的操作较免疫鲨鱼方便。因此，鲨鱼单域抗体的筛选大多选自合成库。人源VH或VL单域抗体一般从VH和VL合成抗体库中进行筛选[10]。

2.1 骆驼VHH免疫文库的构建和筛选 研究者通过对骆驼进行免疫，获得骆驼VHHs的免疫文库；采用结合IgG cDNA的N端和CH2区结合的引物，进行VHH的PCR扩增，再对VHH编码区进行巢式PCR扩增。将PCR产物克隆到噬菌体载体中，建立噬菌体抗体库[11]。

至今，大部分纳米抗体和细胞质/细胞核纳米抗体是从靶蛋白免疫美洲驼后获得的免疫库中筛选得到的。纳米抗体抑制了HIV Rev，HIV Vpr，HIV-1 Nef，流感病毒核蛋白，乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)，9种非结构蛋白，4种猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，猪内源性逆转录病毒基质蛋白，鼠伤寒沙门氏菌SpvB毒素，肉毒梭菌神经毒素蛋白酶，霉菌毒素15-乙酰喔科烟酰胺(15-Acetyldeoxynivalenol，15-AcDON)，蛋白激酶C，F-肌动蛋白 CapG，L-肌动蛋白，肌成束蛋白和cortactin，凝溶胶蛋白，β-链蛋白，2.5二羟基吡啶双加氧酶(NicX)，β2-肾上腺素能受体，马铃薯Y病毒N1a蛋白酶和靶向GFP蛋白(消除真核生物GFP融合蛋白)等的蛋白质功能和活性[12-15]。

天然文库和合成抗体文库的优点是无需对动物进行免疫，缺点是筛选得到的抗体需要进行亲和力成熟。然而，如果这些文库含有大量高度多样性的克隆，且这些克隆针对所有可能的靶点和表位，会增加筛选难度。通过1个克隆步骤，就可以将选定的sdAb转化为胞质/核抗体片段[16]。

2.2 骆驼VHH天然文库的构建和筛选 天然美洲驼VHH文库可以来源于1只动物，为了增加文库多样性，也可以来源于多只动物的血液样本。已构建的天然文库克隆数目范围为107～5×109个。最近纳米抗体核糖体展示技术的发展，使得核糖体-VHH复合物可以在不同表达系统中进行表达。

有学者应用VHH文库筛选得到了细胞质/细胞核的sdAb，针对细胞质/细胞核内的靶点蛋白包括：HCV的非结构性膜蛋白NSB4，Bax，HCV的NS3解旋酶，RNA依赖性RNA聚合酶NS5B，核多聚(A)- 结合蛋白1(PABPN1)和Caspase-3[17]。

2.3 合成VHH文库的构建和筛选 研究者根据天然VHH框架构建了骆驼VHH合成文库。通过CDR的随机化(主要是CDR3)引入了抗原结合的多样性。研究者利用3只未免疫的美洲驼，通过对CDR和框架进行易错PCR，再利用PCR将这些序列与通用框架重叠拼接在一起，通过上述操作，完成了半合成文库的构建。

有学者筛选得到了导致异源核内核糖核蛋白K(Heterogenous nuclear ribonucleoprotein K，hnRPN-K)积累的纳米抗体。此外，筛选得到了明显抑制马铃薯淀粉分支酶的酶活性的纳米抗体[18]。最近，将抗GFP VHH的CDRs与抗-β内酰胺酶VHH的稳定框架结合，构建得到了一种非常稳定的抗GFP纳米抗体，后者是成形素的一个组分，用于果蝇(Decapentaplegic，Dpp)的翼展发育研究。

2.4 人源VH/VL合成文库的构建和筛选 人源VH/VL合成文库是由稳定的人VH/VL种系构建或人单克隆抗体的VH/VL支架构建的。CDR的随机化技术，尤其是针对CDR3的随机化，使得人源VH/VL合成文库具有更高的多样性。最近构建的包含人神经细胞黏附分子1(Neural cell adhesion molecule 1，NCAM1)的Ig1结构域的合成文库，整合了来自鲨鱼克隆的随机化CDR1和CDR3[19]。利用合成文库筛选得到了阻断趋化因子受体CXCR4信号传导活性的嵌合抗体[20]。

有学者根据1个人VH合成文库(利用抗RAS的scFv的VH框架)，筛选得到了抗myc的人VH单域抗体；应用酵母双杂交系统进行CDR3、CDR2和CDR1的逐步随机化，得到了抗myc的特异性抗体；同法筛选得到了抗RAS的人源VH和抗LIM结构域2(LIM domain only 2，LMO2)的人源VH。在小鼠肿瘤模型中，抗RAS 的人源VH抑制RAS依赖性的肿瘤发生，抗LMO2的人源VH抑制裸鼠中的T细胞瘤的形成；根据1个具有随机CDR3的人Κ结构域框架的合成文库，筛选得到了抗上皮激酶(Epithelial kinase，Etk)的VL。

此外，人源VH的骆驼源化，可以通过人源VH框架(主要是框架2)中引入点突变来实现，以使抗体结构更具亲水性。此类骆驼化人源VH框架，已经用于产生CDR3随机单结构库的噬菌体展示系统中，用于改善产物的溶解度和重折叠效率。将兔源抗HIV Vif的VH单域细胞内抗体，与骆驼源的框架相结合，得到了一株有活性的抗体。

2.5 IgNAR可变区(vNAR)合成文库的构建和筛选 vNAR文库的构建，一般是将天然vNAR序列和随机化CDR3环结合形成的半合成文库中进行筛选。使用鲨鱼抗鸡蛋白溶菌酶的IgNAR VH克隆作为框架，结合随机化CDR3环形成半合成文库。最近研究显示，根据2型铰口鲨鱼的VNAR框架，结合多个框架突变和部分随机化的CDR3的鲨鱼抗体库，可筛选出可以阻断BAFF与其全部3种受体结合，抗BAFF的中和vNAR单域抗体。目前，未见有关鲨鱼细胞质/细胞核sdAb筛选的相关报道。

为了筛选特异性sdAb，将sdAb展示在噬菌体或酵母细胞的细胞表面上。将重组噬菌体抗体库与固定抗原(生物淘选)一起温育，将筛选得到的特异性结合物克隆到细胞质或细胞核的靶向载体中，得到的细胞质/细胞核胞内抗体，将在靶细胞、异种移植肿瘤小鼠模型或转基因sdAb小鼠中进行评估。

最近，一种用于鉴定功能性sdAb的新的筛选方法正处于开发阶段，该试验采用灭活A型流感病毒(Inactivated influenza A virus，IAV)和水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)免疫羊驼。随后将VHH的 cDNA直接克隆到逆转录病毒载体中，以产生慢病毒颗粒。然后，用重组病毒感染A549细胞，48 h后，用IAV和VSV的致死剂量进行处理。对存活菌落进行鉴定，确定VHH序列。筛选得到19种可以特异性阻断IAV或VSV细胞感染的VHH抗体[21]。这种筛选方法适用于鉴定病原体或生物学途径的抑制剂。

大多数sdAb筛选是通过噬菌体展示系统，而不使用细菌、酵母或哺乳动物双杂交系统。这种方法可靠，可用于筛选细胞质/细胞核scFv片段和sdAb，因为这种筛选可以得到正确折叠的scFv片段或sdAb，而不是高亲和力的scFv片段或sdAb。然而，抗体亲和力是否是细胞内抗体有效的唯一先决条件尚不明确。细菌、酵母或哺乳动物双杂交系统可以在不需要纯化抗原的情况下，直接在细胞内筛选功能性细胞质/细胞核抗体。另一种双杂交检测技术，允许直接研究活细胞中2种蛋白质的相互作用。荧光标记的猎物蛋白和荧光标记lacI (lac操纵子抑制剂)融合的相应诱饵蛋白，在包含染色体整合的lac操纵子的哺乳动物细胞一起表达。两个分子的相互作用，导致两个不同的荧光信号在lac操纵子上共定位，并可在细胞核内观察到。

3 细胞质/细胞核单域抗体的筛选

针对40多种细胞质/细胞核靶点和35种ER内瞬时蛋白，研究者进行了纳米抗体的筛选。大多数sdAb靶点属于病毒或致癌蛋白，其次是毒素和神经系统蛋白。

细胞质内抗体也在植物和果蝇中得到成功表达。单域胞内抗体部分保护了马铃薯植株免受马铃薯病毒Y的侵害。目前，研究者开发了一种监测活细胞中蛋白质敲除的通用方法。将抗GFP VHH与果蝇Slmb的F-box结构域融合，通过泛素耗尽通路以降解和GFP融合靶点蛋白。该技术被用于降解转录因子和参与转基因Drosophila monogaster果蝇形态发育的相关蛋白，转基因果蝇表达GFP-靶点融合蛋白和抗GFP的VHH片段。此外，其开发了抗eGFP-CD8跨膜结构域-细胞质mCherry的融合蛋白(简称Morphotrap)，用于研究表达eGFP-Dpp (Decapentaplegic，形态生成蛋白)转基因果蝇翼片的发育情况。Morphotrap将eGFP-Dpp固定在细胞表面，抑制了翼片图案的形成。使用具有序列选择性和核酸水解的纳米抗体用于基因沉默[22]。

大多数sdAbs已经在细胞培养中进行了评估，并且少数已经在小鼠模型中进行了研究。在移植表达相应胞内抗体的肿瘤细胞的裸鼠或NOD-SCID小鼠中，针对LMO2、F-肌动蛋白和RAS的sdAbs进行了研究[23]。在CD4+/HIVNEF转基因小鼠的实验中，抗HIV-1的Nef细胞内抗体能够拯救Nef介导的胸腺CD4+T细胞成熟缺陷和外周CD4+T细胞的激活。将SH3结构域与筛选的纳米抗体结合，可以增强针对HIV-1的Nef的抑制功能。此外，筛选无半胱氨酸的人源VL片段，较原始抗体具有更好的活性。将半胱氨酸残基改变为缬氨酸和丙氨酸，可以降低抗体的亲和力；可以在易错PCR导致的随机突变中，筛选无半胱氨酸的人源VL片段变体[24]。针对病毒蛋白、毒素、致癌蛋白和神经系统蛋白的几种纳米抗体具有潜在的治疗前景。

4 细胞质/细胞核sdAbs的细胞内转染

与病毒转染或质粒转染不同，细胞内抗体可以作为蛋白质递送到胞质中。将scFv或纳米抗体形式的胞内抗体递送到靶细胞胞质中，可使递送过程中细胞内抗体保留二硫键，维持了正确的折叠结构。此外，这种方法可能成为临床应用中病毒基因转移的安全替代方案。

研究者使用不同保护性剂进行抗体向细胞质的递送，并与电转技术进行了比较研究，电穿孔是目前比较有效的技术。

此外，通过使用穿透肽或靶向蛋白，与易位结构域形成的融合蛋白，可以帮助配体或抗体通过细胞膜，也可以使用穿透肽与内涵体逃逸结构域形成融合蛋白，来解决蛋白进入细胞的问题。因为内涵体逃逸效率低，所以，肽和蛋白质融合蛋白通过细胞膜到达细胞质基本无效。但是，通过核苷补救途径，细胞穿梭抗DNA抗体可以定位于细胞核，并与特异性靶向scFv结合[25]。

细胞穿透肽具有明显优势，使用细胞穿透肽适配体系统可以构建TAT-钙调蛋白融合体，以及钙调蛋白和货物组成的融合体。TAT-钙调蛋白和货物之间是非共价结合，将货物递送、释放到细胞质中。另一种策略是使用细胞穿透肽和硫酸类肝素葡糖胺聚糖结合形成一个蛋白质梭肽的结构域。这些系统已经在一些难以转染的细胞类型中成功使用，如小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells，mESCs)、人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)等。此外，针对HCV蛋白的骆驼源纳米抗体和细胞穿透肽融合，并成功应用于HVC感染细胞中[26]。

有研究表明，成骨细胞转录因子Runx2可以由肽牙本质磷酸化蛋白介导，靶向到间充质细胞的细胞核，而绕过了溶酶体降解途径。最近研发的一种血清稳定和低毒性的分子转运蛋白，由1个刚性平面核心和4个灵活臂组成，每个臂上有1个胍基团，可以有效地将小货物或大的活性蛋白质输送到细胞质中。将靶向内涵体逃逸区的TAT细胞穿透肽与GFPβ11肽结合，当GFPβ11和非荧光GFPβ1-10结合时，可以激发化学形成的GFP荧光发光。这种方法可以用于筛选内涵体逃逸区[27]。

高效循环细胞穿透肽可以从内涵体中释放，再循环利用。将纳米抗体框架区的水溶性残基突变为带正电的精氨酸或赖氨酸，可以增加纳米抗体的细胞穿透能力，将来这种抗体框架区可以作为通用支架用于抗体的细胞内输送。

另一种方法是使用致病菌Ⅵ型分泌途径将sdAb转运到人类细胞中。这种sdAb的注射不需要细菌侵入或遗传物质的转运。

由纳米抗体修饰的纳米颗粒介导的特异性递送药物或毒素的方法，已经在许多体外实验中得到证实，并且逐步开始进行体内实验。聚合物基体和聚复合物是较新的人造囊泡，更易于被聚合物结构单元修饰。将sdAb或sdAb表达质粒包裹在纳米颗粒中，纳米颗粒被抗受体纳米抗体(如：抗EGFR的纳米抗体)修饰，这种修饰后的药物纳米颗粒可以递送抗癌单域抗体到达肿瘤细胞。另外，利用转铁蛋白或Angiopep-2包被的纳米颗粒/纳米管，可以穿过血脑屏障，其中Angiopep-2是一种低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(Low-density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP1)配体。这种递送药物可能被用于细胞质/细胞核单域胞内抗体(如：识别hungtington蛋白或α-Synuclein的抗体)的脑内递送[28-30]。

5 结论

来自骆驼、鲨鱼和人的单域抗体对于有效和特异性地敲除体内细胞质和细胞核蛋白是非常有用的。特异性靶向相互作用区域包括：蛋白质的构象异构体，剪接变体，亚型，翻译后修饰位点(如：磷酸化位点等)，使得胞内抗体具有独特的使用价值。即使有报道，RNAi可以特异性抑制Hungtington蛋白等位基因及灭活p53致癌突变[31]，RNAi技术具有明显的脱靶效应。

在合成文库，骆驼、鲨鱼和人的单域抗体文库中，通过噬菌体或酵母展示技术的筛选，理论上可以筛选出任何抗原和表位的大量的单域细胞内抗体。通过 CDR突变引入，突变热点随机化或易错PCR构建非亲和力成熟文库，在文库中进行高亲和力抗体的筛选，进而达到抗体的亲和力成熟的目的。重组慢病毒筛选技术有望代替现有的噬菌体筛选技术，用于特异性抑制性dAbs的筛选。

将细胞穿透肽、优化的内涵体逃逸结构域、sdAb表达质粒或重组sdAb嵌入到聚合物囊泡和多聚复合物囊泡的纳米颗粒中，纳米颗粒完成细胞质/细胞核单域胞内抗体的药物细胞内递送，单域胞内抗体药物才能被应用于临床实践。

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