贵州省茶树黑刺粉虱的鉴定

陈 瑶，杨 文，周玉锋，刘惠芳,杨茂发

(1.贵州大学 昆虫研究所,贵州 贵阳 550025；2.贵州省山地农业病虫害综合防治重点实验室,贵州 贵阳 550025；3.贵州省农业科学院 茶叶研究所,贵州 贵阳 550006)

长期以来，茶树黑刺粉虱种群和柑橘黑刺粉虱种群均被认为是一个种，都以拉丁学名Aleurocauthusspiuiferus(Quaintance)表示。2010年，Kasai等[1]研究发现，茶树黑刺粉虱并不接受柑橘叶片作为寄主。2011年，日本研究人员通过大量的试验发现柑橘黑刺粉虱和茶树黑刺粉虱在成虫前翅的斑纹数、生殖器，蛹边缘蜡状分泌物的宽度、边缘细褶皱数、乳状突等10个形态方面存在明显差异，并采用线粒体COI基因序列分析鉴定了柑橘黑刺粉虱和茶树黑刺粉虱，从而证明日本境内茶树上的黑刺粉虱与柑橘黑刺粉虱A.spiniferus(Quaintance) 存在差别，并提出了茶树上黑刺粉虱种群的新学名A.camelliaeKanmiya & Kasai和新的俗名为camellia spiny whitefly (茶树黑刺粉虱)[2-3]。至今，还没有针对我国境内茶树黑刺粉虱种类鉴定的研究报道，仅2012年胡雅辉等[4]根据湖南省柑橘黑刺粉虱和茶树黑刺粉虱线粒体COI基因片段遗传距离存在明显的差别，从而推断出两种群属于黑刺粉虱的不同生物型或不同种的Aleurocanthus属粉虱。贵州省茶树种植面积列全国第一，茶树黑刺粉虱在贵州不同茶区均有发生，个别茶园近年爆发成灾，明确贵州茶园黑刺粉虱的种类，研究其形态特征为该虫的发生监测及防治提供理论依据。为明确贵州茶树黑刺粉虱的种类，本文采用线粒体COI基因的DNA条形码技术和形态特征相结合的方法，开展了贵州茶树黑刺粉虱的鉴定，为茶树黑刺粉虱的科学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 贵州省茶树黑刺粉虱的分子鉴定

1.1.1 采样地点 本实验所用的黑刺粉虱是2015—2016年采自贵州10个产茶县共12个不同地点的茶园，采样点信息见表1。实验所用虫态均为蛹或若虫。采集时，用拨针将茶树叶片上的黑刺粉虱蛹或若虫拨下直接浸泡于1.5 mL装有无水乙醇的离心管中，带回实验室后保存在-20 ℃冰箱中备用。

表1 采样地信息Tab.1 General informations for sampling

1.1.2 实验方法 (1)黑刺粉虱DNA的提取。在-20 ℃冰箱保存的离心管中，取10头伪蛹或若虫，单头提取DNA，提取方法按照参考文献[3]的方法。(2)茶树黑刺粉虱引物的设计与合成。扩增黑刺粉虱mtCOI基因的引物为参考文献[3]述及的茶树黑刺粉虱特异性引物。引物序列分别为：

上游引物AsFcha：5′-ATTTCACACTTAATTAGGAGTGA-3′

下游引物AsR4cha：5′-CTGCACGAAATACAACAAATGC-3′

PCR反应总体积50 μL反应体系，各组分如下：模板DNA 1 μL，10PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCL25 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，引物AsFcha和AsR4cha(20 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 35.5 μL，所用材料均购自生物工程上海(股份)有限公司。PCR扩增在PTC-200型扩增仪上完成，程序为95 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35次循环，72 ℃延伸5 min。取5 μL扩增产物，进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后在紫外光下检测结果并拍照。所得目的片段送生物公司采用PCR产物直接双向测序。(3)数据分析。测序结果与Kanmiya等[2]研究结果的COI基因片段比对，用MEGA 6.0软件[5]构建系统发育树，建树方法为基于Kimura 2模型的最大似然法[6]，系统树各分支置信度用Boostrap 1 000次重复检验。

1.2 贵州省茶树黑刺粉虱的形态特征观察

按照参考文献[2]的方法，采集贵州省农业科学院茶园中茶树黑刺粉虱的成虫、卵、若虫和蛹，采用超景深三维显微系统(KEYENCE VHX-5000)进行形态观察。

2 结果与分析

2.1 贵州省茶树黑刺粉虱的分子鉴定

利用MEGA6基于最大似然法、Kimura 2模型构建进化树，分支处上方的值是重复1 000次后自展值The phylogenetic tree was conducted by using the Maximum Likelihood method based on the Kimura 2-parameter model in MEGA6 with 1 000 bootstrap replicates图1 黑刺粉虱系统进化树Fig.1 Molecular phylogenetic tree of Aleurocanthus sp.

本研究用来构建系统进化树的COI基因序列共36条，其中12条是采自贵州省茶园虫样的序列，其编号见表1，13条来自NCBI上已公布的茶树黑刺粉虱种群(登录号分别为AB536794、AB536795、AB536796、AB536797、AB536798、AB536799、AB536800、AB615363、LC088497、AB786712、AB786713、AB786714和KJ437166)，3条来自柑橘黑刺粉虱种群(登录号为AB536792、AB536793和AB558172)，此外还包括来自Aleurotracheluscamelliae(AB536801)、Aleurocanthusbangalorensis(KY624597)、Aleurocanthuscitriperdus(HM150620)、Aleurocanthusinceratus(HM150621)、Aleurocanthuswoglumi(JX281760)、Aleurocanthussp.9WZ-2010 (HM150622)、Aleurocanthussp.BIOUG02542-C05(KY835557)、Aleurocanthussp.BIOUG02542-E07(KY836994)的各1条序列。将所有序列在Clustalx软件上进行多序列比对，然后利用MEGA 6.0软件进行系统进化树构建(图1)。 采自于贵州省12个不同茶园的黑刺粉虱与已明确鉴定的13个茶树黑刺粉虱A.camelliae聚在了同一个亚组，且明显区分于日本柑橘的黑刺粉虱A.spiniferus。此外，利用DNAMAN软件对贵州的12个样品序列与KJ437166的上述引物间序列进行比对，12个样品间序列高度相似，且与KJ437166的序列同样具有高度相似性。

2.2 贵州省茶树黑刺粉虱的形态特征

2.2.1 成虫 成虫体长1.10～1.79 mm，宽0.52～0.73 mm；头胸部暗褐色，覆白色蜡粉；复眼红色；腹部橙黄色；前翅由浅棕色变成紫褐色，覆白色蜡粉，上有9个不规则白色斑纹；后翅淡紫褐色，无白色斑纹；足黄色，腿节和基节微黄色，然后变成浅棕色，深棕色，前足颜色较中足、后足淡，也覆有白色蜡粉；触角4～7节，黄色(图2)。

A：成虫背面；B：成虫腹面；C,D：成虫侧面；E：初羽化成虫前翅，具9个不规则白色斑纹；F：成虫前翅，具9个不规则白色斑纹；G：成虫后翅A：adult,dorsal view;B：adult,abdominal view;C,D：adult,lateral view;E：the early adult fore-wings,with 9 white maculae irregular white markings;F：fore wing of adult,with 9 white maculae irregular white markings;G：hind wing of adult图2 茶树黑刺粉虱成虫Fig.2 Adult photomicrographs of A.camelliae

2.2.2 卵 卵长约0.14～0.17 mm，宽0.08～0.10 mm，长椭圆形，稍弯曲，顶部较尖，基部钝圆，有一短柄固着在叶背上，初产时乳白色、淡黄色，后渐变黄褐色、黑褐色(图3)。

2.2.3 若虫 若虫共4龄，呈椭圆形，初孵若虫无色透明，能爬行，固定后很快变成黑色，有光泽，各龄若虫均在体躯周围分泌一圈白色蜡质物。一龄若虫：体长0.24～0.30 mm，宽0.10～0.14 mm，椭圆形，体背有6根浅色刺毛，边缘出现白色蜡质物，并逐渐加宽(图4)。

二龄若虫：体长0.35～0.43 mm，宽0.20～0.27 mm，胸部分节不明显，腹部分节明显，头胸部6对刺毛，腹部侧背面4对刺毛，其中以胸部中间2对最长(图5)。

A：初产卵乳白色；B：卵后期变成黑褐色；C,D：卵具一短柄；E-G：孵化后具明显孔口的卵壳A：newly deposited eggs pale;B：the egg turns brown to darker before hatching;C,D：the egg has a short stalk;E-G：the egg shell has a obvious orifice after hatching图3 茶树黑刺粉虱卵Fig.3 ovum photomicrographs of A.camelliae

A：边缘局部初现白色蜡质物；B：边缘四周初现白色蜡质物；C：边缘白色蜡质物逐渐加宽A：the edge is surrounded by white marginal waxy partially；B：the edge is surrounded by white marginal waxy；C：the edge of white waxy is gradually widened图4 茶树黑刺粉虱一龄若虫 Fig.4 1st-instar nymph photomicrographs of A.camelliae

三龄若虫：体长0.52～0.69 mm，宽0.33～0.43 mm，腹部前半分节不明显，但胸节分界明显；体背具长短刺毛14对(胸部前方1对短毛不计)，背部附有1个三角形的若虫蜕皮壳(图6)。

四龄若虫近似三龄若虫，体长0.78～1.29 mm，宽0.52～0.77 mm，背部附有2个重叠的三角形若虫蜕皮壳(图7)。

A：正面图；B：侧面图 A：positive view;B：lateral view图5 茶树黑刺粉虱二龄若虫 Fig.5 Photomicrographs of 2nd-instar nymph A.camelliae

图6 三龄若虫Fig.6 3rd-instar nymph

2.2.4 蛹 蛹长0.90～1.32 mm，宽0.50～0.89 mm，椭圆形，漆黑色，有光泽，边缘成锯齿状，周围有较宽的白色蜡边，背面显著隆起，背盘区胸部有长短刺毛9对，腹部10对；边缘雌蛹有长短刺毛 11对，雄蛹10对，且向上竖立(图8)。

图7 四龄若虫Fig.7 4th-instar nymph

3 讨论与结论

3.1 茶树黑刺粉虱类群COI基因

韩敏[7]通过mtDNA-COI基因序列分析了全国22个黑刺粉虱不同地理种群的遗传差异；根据mtDNA-COI基因序列，采用3种方法构建了系统树，其结果表明黑刺粉虱不同地理种群之间亲缘关系与地理分布存在一定相关性。胡雅辉等[4]通过mtDNA-COI基因序列分析了湖南20个黑刺粉虱种群遗传距离，根据其mtDNA-COI基因序列建立的系统树，柑橘黑刺粉虱种群和茶园黑刺粉虱种群之间的遗传距离明显高于柑橘黑刺粉虱不同地理种群之间的遗传距离，也明显高于茶园黑刺粉虱不同地理种群之间的遗传距离。由此推断柑橘黑刺粉虱和茶园黑刺粉虱属于黑刺粉虱的不同生物型，或不同种的Aleurocanthus属粉虱。Kanmiya等[2]通过mtDNA-COI基因序列分析了日本11个黑刺粉虱种群遗传距离，根据建立的系统树，来自日本8个地区的茶树黑刺粉虱种群聚为一大类，来自日本3个地区的柑橘黑刺粉虱种群聚为一大类，两种群之间差别明显。Chen等[8]研究了柑橘黑刺粉虱完整COI基因对其系统发育的影响，在文章中并未对柑橘黑刺粉虱和茶园黑刺粉虱进行区分，两者的学名任是统一沿用A.spiniferus。

本研究对采自于贵州省10个茶区共12个茶树黑刺粉虱进行了分子鉴定，将测试的贵州省12条不同茶园的mtDNA-COI基因序列进行序列比对，结果显示这些序列彼此间高度相似，表明这12个样品很有可能属于同一个种群；此外，系统聚类分析显示它们与已确认的13个茶树黑刺粉虱A.camelliae聚在了同一个亚组，且明显区分于日本柑橘黑刺粉虱A.spiniferus[2]，表明这12个样品属于茶树黑刺粉虱类群。另外，在NCBI上，登录号为KJ437166的是Aleurocanthusspiniferus的线粒体基因组序列，对贵州的12个样品以及KJ437166的引物间序列进行比对，结果显示这些序列间高度相似，同时结合系统进化结果，KJ437166应属于Aleurocanthuscamelliae。

3.2 茶树黑刺粉虱形态特征的相关描述

2011年以前，国内外相关文献所报道的茶树黑刺粉虱均一直沿用柑橘黑刺粉虱的学名A.spiniferus(Quaintance)。2010年至2011年，日本研究人员证明日本境内茶树上的黑刺粉虱与柑橘黑刺粉虱A.spiniferus(Quaintance) 存在差别，并明确了茶树上黑刺粉虱种群的新学名A.camelliaeKanmiya & Kasai[2-3]。

在我国，对茶树上黑刺粉虱形态特征进行观察和描述的最早报道时间是1979年[9]；靳永等[10]在解剖镜或光学显微镜下观察了黑刺粉虱形态特征，其所用种名是A.spiniferus(Quaintance)。至今，我国还没有针对我国境内茶树黑刺粉虱的鉴定研究，仅是2012年胡雅辉等[4]根据湖南省柑橘黑刺粉虱和茶树黑刺粉虱线粒体COI基因片段遗传距离存在明显的差别，从而推断出两种群属于黑刺粉虱的不同生物型或不同种的Aleurocanthus属粉虱[4]。

Kanmiya等[2]根据将其所观察的茶树黑刺粉虱A.camelliae的形态特征与柑橘黑刺粉虱A.spiniferus的形态特征进行对比，找出蛹和成虫共10个形态特征有差异，其中最易区别的是成虫的前翅，A.spiniferus前翅有7个白斑，而A.camelliae有9个。国内相关文献报道的各个虫态的形态特征中，所描述的成虫前翅上均为7个不规则白色斑纹[9-10]。国内相关文献所描述的卵形态特征与Kanmiya等的观察描述大同小异；但是各龄若虫分龄及其体背刺毛数量和蜕皮壳数量的主要特征观察描述各异，且与Kanmiya等的观察描述不尽相同[9-10]。

本研究成虫前翅上有9个不规则白色斑纹的观察结果与Kanmiya等[2]观察的茶树黑刺粉虱类群相同，但明显区别于国内相关文献所描述的成虫前翅上均为7个不规则白色斑纹。在本研究卵、若虫和蛹3个虫态的重要形态特征中，卵的颜色变化为初产时乳白色、淡黄色，后渐变黄褐色、黑褐色；一龄若虫体背有6根浅色刺毛，二龄若虫体背有10对刺毛，三龄若虫体背具14对刺毛且背部附有1个三角形的若虫蜕皮壳，四龄若虫体背具14对刺毛且背部附有2个重叠的三角形若虫蜕皮壳。这些形态特征的观察结果与Kanmiya等[2]的观察描述一致。因此，本研究形态观察结果中，各虫态的相关形态特征与国内相关报道的描述不尽相同，但与日本Kanmiya等[2]报道的A.camelliae的形态特征描述一致。

通过分子鉴定和形态观察结果表明，贵州茶区茶树黑刺粉虱与日本学者Kanmiya 等的研究结果一致，新学名应为已报道的A.camelliaeKanmiya & Kasai。本研究仅明确了贵州茶区黑刺粉虱种类，但是全国各大茶区黑刺粉虱的鉴定至今未见报道，因此，全国范围内茶树黑刺粉虱种群的鉴定有待开展。

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