高效液相色谱法检测蜂蜜中的氯霉素

2018-06-29肖婉娜陈怡佳

农产品加工 2018年12期

关键词：氯霉素检出限液相

肖婉娜，何敏，陈怡佳

（广东科贸职业学院，广东广州 510430）

氯霉素属抑菌性广谱抗生素，对人体的造血系统有很大的毒副作用[1]。目前很多企业对该药物残留的检测采用快速检测法，难以定量。因此，试验采用液相色谱法检测蜂蜜中的氯霉素，并与快速检测法进行对比。

1 试验材料

1.1 材料

甲醇、乙腈（HPLC级）；氯霉素、乙酸乙酯、氢氧化钠、磷酸氢二铵等，均为分析纯；蜂蜜；快检试剂盒。

1.2 仪器

岛津LC-15C型、DL-360B型超声波清洗器，RE-52AA型旋转蒸发仪，TG16-WS型离心机等。

2 试验方法

2.1 液相色谱检测方法探究

2.1.1 样品前处理方法的选择

（1）方法1（化学法[2]）。称10 g蜂蜜加入5 mL水混匀，再加20 mL乙酸乙酯超声处理30 s，然后加入NaCl和NaOH超声处理2 min后离心，移出提取液。再向残渣中加入乙酸乙酯重复上述提取步骤，合并提取液，减压旋干，用乙腈溶解，加MgSO4离心，上清液待测。

（2）方法2（固相萃取法[3]）。称10 g蜂蜜加水5 mL，再加入20 mL乙酸乙酯，振荡后离心，吸取乙酸乙酯减压蒸干，加入5 mL水溶解残渣，倒入活化好的固相萃取柱淋洗，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱液吹干，用乙腈溶解待测。

2.1.2 流动相和柱温的选择

C18色谱柱、紫外278 nm，采用不同流动相（a.40%甲醇-0.2%磷酸氢二铵；b.30%乙腈-水；c.30%甲醇-水）和不同柱温（室温，30，40，50，60℃）进行采集。

2.1.3 阴性对照

取流动相进样，再取不同浓度氯霉素溶液做峰增高法定性。

2.2 方法验证

2.2.1 线性关系

配制1 mg/mL氯霉素甲醇储备液，再稀释成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制工作曲线。

2.2.2 回收率和精密度

称蜂蜜4份，分别加入不同质量浓度的氯霉素对照品溶液，使蜂蜜中氯霉素的质量浓度为0.1，8.0，40 μg/kg，平行测定3次，计算回收率。再称取蜂蜜6份，按相同方法制备供试品溶液，重复进样，计算RSD值。

2.2.3 检出限和定量限

取标液不断稀释，当信噪比为3时作为方法的检出限，信噪比为10时为方法的定量限[4]。

2.3 高效液相色谱法与快速检测法的比较

称取7份含有氯霉素蜂蜜用空白蜂蜜稀释成不同质量浓度，记为样①～⑦号，同时做快速检测和液相检测；再将对照液稀释成0.100，0.05，0.04，0.03，0.02，0.01 ng/mL进行快检，将对照品的显色结果作为样品的参照，推出蜂蜜中氯霉素的实际质量浓度，得到快速检测法的检出限，与液相色谱法的检出限进行对比。

3 结果与讨论

3.1 方法选择

3.1.1 不同净化方法的对比

不同方法制备的供试品溶液的液相谱图比较见图1。

图1 不同方法制备的供试品溶液的液相谱图比较

图3 不同氯霉素浓度蜂蜜试液的色谱图

从图1可以看出，化学法除杂效果较差，虽氯霉素检出含量高，但可能是在保留时间处有其他杂质与目标物重叠。

3.1.2 流动相和柱温的选择

不同流动相洗脱的液相结果见表1。

表1 不同流动相洗脱的液相结果

流动相c氯霉素出峰最晚，流动相b出峰最快；理论塔板数c＞b＞a＞4 000，符合药典要求，且氯霉素都能完全分离，峰形也较好。流动相a含有缓冲盐，配制和冲洗过程较繁琐；流动相c的洗脱能力比b弱，在冲洗时会消耗较多试剂，因此，流动相b最合适。

不同柱温下液相结果见表2。

表2 不同柱温下液相结果

当流动相和色谱柱之间的温差增大时，由于温度不平衡会导致的峰变形加剧[5]，从表2可以看出，柱温20～60℃时，随柱温升高，保留时间变短，同时分离度、峰宽也发生变化，升高柱温会使塔板数降低，峰形变差。综合考虑，选40℃作为检测柱温。

3.1.3 阴性对照

流动相的液相色谱见图2，不同氯霉素质量浓度蜂蜜试液的色谱见图3。

图2 流动相的液相色谱图

从图2～图3可以看出，标液中2.537 min的峰是溶剂峰，6.410 min的为氯霉素峰，2.011 min的峰为杂峰。

3.2 方法验证

3.2.1 线性关系考查

氯霉素对照品标准曲线见图4。

图4 氯霉素对照品标准曲线

从图4的公式和相关系数看出，对照品溶液在0.10～10.00 μg/mL的范围内线性良好。

3.2.2 回收率和精密度

加标回收率平均为81.68%，RSD值为10.81%，该方法准确度和精密度较好。

3.2.3 检出限和定量限

氯霉素标液稀释至S/N=3.56时所对应的质量浓度为0.5 ng/mL，在蜂蜜中的检出限为0.625 μg/kg。S/N=10.81时所对应的质量浓度为10 ng/mL，则方法的定量限为 8 μg/kg。

3.3 液相色谱法与快速检测法的比较

不同质量浓度氯霉素的样品快检结果对比见表3，不同质量浓度对照品溶液快检结果见表4。

表3 不同质量浓度氯霉素的样品快检结果对比

+++++++++++++++++++++++++++注：“+”表示颜色的深度，“+”越多则颜色越深检测项目空白样⑦样⑥样⑤样④样③样②样①C T++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

表4 不同质量浓度对照品溶液快检结果

根据说明书，测试线T比对照线C深或相同，则氯霉素质量浓度低于检出限或不含氯霉素。若T比C浅表示氯霉素质量浓度高于检出限，越浅则质量浓度越高。因此看表3和4中样①和标0.01 ng/mL快检阳性，经换算此时蜂蜜中氯霉素含量0.125 μg/kg。随着样品与标中氯霉素质量浓度降低，T渐深，到样⑤和标0.04 ng/mL T仍比C浅，说明氯霉素仍能检出，到样⑥和标0.05 ng/mL时，T与C完全一致，氯霉素已检不出。因此样⑤和标0.04 ng/mL是氯霉素检出限，经换算得快检法氯霉素检出限为 0.062 5 μg/kg。在 0.125～0.062 5 μg/kg 时，快检颜色变化成一定梯度，可做作为半定量的依据。

蜂蜜样与氯霉素对照品的色谱见图6。