HBx抑制RASSF1A表达参与肝细胞癌发生的可能机制

宋蕴薇，仇雪梅，陆森，樊红

(1. 东南大学医学院 遗传与发育生物学系，江苏 南京 210009； 2. 江苏省中医药研究院，江苏 南京210028； 3. 枣庄市妇幼保健院，山东 枣庄 277100； 4. 江苏省人民医院，江苏 南京 210029)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染是我国HCC重要的致病因素之一[1]。HBx基因是HBV病毒基因组中最小的开放性阅读框，其蛋白作为多功能蛋白，广泛参与病毒的复制、宿主细胞的基因调控和表达等过程[2]。在HBx致肝癌发生的研究中发现，HBx可以通过上调DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表达使抑癌基因的启动子区发生甲基化从而抑制其表达[3]。

RAS相关结构域家族1A(RASSF1A)是近年发现的一个重要抑癌基因。其启动子区DNA甲基化引起的基因失活，与多种癌症的发展有关[4-6]。HBx可能通过激活DNMT1的表达[7]，造成RASSF1A启动子区DNA甲基化状态改变致其失活，参与肝癌的发生和发展。本研究分析了肝细胞永生化细胞系及HCC细胞系中HBx的表达水平与RASSF1A基因表达水平之间的相关性，进而分析HBx对RASSF1A表达抑制的可能机制以及RASSF1A基因的低表达是否受其启动子区甲基化的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系

正常肝细胞永生化细胞系L02、Chang liver，HCC癌旁细胞系QSG-7701，HCC细胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2，稳定转染HBV病毒的HCC细胞系HepG2.2.15，稳定转染HBx基因的正常肝细胞永生化细胞系L02-X1#1、L02-X1#8及转染空白载体的对照细胞系L02-TR#19。

1.2 RT-PCR及qPCR

抽提细胞系的总RNA，以制备cDNA第一链，进行PCR扩增，所用引物如下：β-肌动蛋白：正向引物5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，反向引物5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′；RASSF1A：正向引物5′-TCATCTGGGGCGTCGTG-3′，反向引物5′-CGTTCGTGTCCCGCTCC-3′；HBx：正向引物5′-GACGTCCTTTGTCTACGTCC-3′，反向引物5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′;DNMT1：正向引物5′-CCGAGTTGGTGATGGTGTGTAC-3′，反向引物5′-AGGTTGATGCTGCGTGGTAGC-3′。

1.3 转染细胞系

HCC癌旁细胞系QSG-7701、HCC细胞系SMMC-7721中转染HBx基因构建细胞模型QSG-7701-X1(转染了HBx全长基因表达载体)、QSG-7701-X2(转染了HBx截短序列表达载体)、转染空白载体的对照细胞系QSG-7701-空白对照、SMMC-7721-X1(转染了HBx全长基因表达载体)、SMMC-7721-X2(转染了HBx截短序列表达载体)及转染空白载体的对照细胞系SMMC-7721-空白对照；建立稳定转染DNMT1 siRNA载体的HCC细胞系SMMC-7721-DNMT1 siRNA，及其对照细胞系SMMC-7721-DNMT1。

1.4 DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5′-aza)处理细胞

将携有HBx基因的HCC细胞系MHCC-97H培养至汇合率30%时，分别以含有0、5、10、25及50 μmol·L-1的5′-aza RPMI 1640培养基继续培养48 h后，更换为正常的培养基培养24 h使细胞回复生长。

1.5 亚硫酸氢盐基因组测序(bisulfite genomic sequencing, BGS)

将用亚硫酸氢盐法修饰纯化过的DNA为模板，以半巢氏PCR方式扩增，引物分别为：MU379：5′-GTTTTGGTAGTTTAATGAGTTTAGGTTTTTT-3′； ML730：5′-ACCCTCTTCCTCTAACACAATAAAACTAACC-3′；ML561：5′-CCCCACAATCCCTACACCCAAAT-3′。其中MU379和ML730行第1轮PCR扩增，MU379和ML561行第2轮PCR扩增。扩增的PCR产物连接转化入感受态的DH5α大肠杆菌中，挑取单克隆菌落，培养后进行菌液PCR，取8个阳性克隆过夜培养后菌液送华大基因公司测序。

2 结 果

2.1 RASSF1A在HCC细胞系中表达水平分析

在正常肝细胞永生化细胞系L02、Chang liver，HCC癌旁细胞系QSG-7701，HCC细胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2与HepG2.215中，应用RT-PCR与qPCR方法检测RASSF1A的表达水平。结果发现，与正常肝细胞永生化细胞系L02、Chang liver和HCC癌旁细胞系QSG-7701相比，RASSF1A在HCC细胞系SMMC-7721、BEL-7405、MHCC-97H、MHCC-97L、HepG2和HepG2.215中的表达水平明显降低，且在MHCC-97H、MHCC-97L和HepG2.215细胞中均可检测出HBx的表达(图1A、B)。

图1RASSF1A及HBx基因在HCC细胞系中的表达分析
A.qPCR方法检测RASSF1A在HCC细胞系中的表达水平； B.RT-PCR结果显示RASSF1A及HBx在HCC细胞系中的表达水平

Fig1ExpressionanalysisofRASSF1AandHBxinHCCcelllines

2.2 HBx基因表达载体的转染抑制了RASSF1A基因的表达

与转染对照空载体的L02-X1#19细胞系相比，RASSF1A在转染HBx基因全长表达载体细胞系L02-X1#8中表达水平下降(图2A)。在转染HBx基因全长的细胞系QSG-7701-X1、SMMC-7721-X1及转染HBx截短序列的细胞系QSG-7701-X2中，RASSF1A的表达水平亦存在下降趋势(图2B)。

图2HBx基因的导入影响了RASSF1A的表达水平
A.转染HBx表达载体的L02细胞系中RASSF1A的表达变化； B.转染HBx表达载体的QSG-7701和SMMC-7721细胞系中RASSF1A的表达变化

Fig2ThetransformationofHBxaffectedtheexpressionlevelofRASSF1A

2.3 DNA甲基转移酶抑制剂5′-aza使RASSF1A基因出现回复表达

为了检测HCC细胞中RASSF1A的表达水平是否受DNA甲基化的影响，本研究在表达HBx基因的HCC细胞系MHCC-97H中行浓度梯度式5′-aza处理。提取处理组总RNA，以RT-PCR检测RASSF1A表达水平，结果显示，MHCC-97H细胞系中，5′-aza的处理升高了RASSF1A的表达水平，且表现为RASSF1A的表达水平与5′-aza的处理剂量的依赖关系(图3A)。

图3干预DNA甲基化转移酶的表达与活性影响了RASSF1A的表达水平
A.RT-PCR检测MHCC-97H细胞系在5′-aza处理后RASSF1A的表达情况； B.在DNMT1敲低的SMMC-7721细胞系中分析RASSF1A的表达变化

Fig3InterferenceofDNAmethyltransferasesexpressionandactivitychangedtheexpressionlevelofRASSF1A

2.4 敲低DNMT1能够诱导RASSF1A的表达

由于DNA甲基转移酶抑制剂5′-aza主要作用于DNMT1，本研究在转染DNMT1 siRNA及其对照载体的HCC细胞系SMMC-7721中，应用RT-PCR检测了RASSF1A表达水平的变化，结果发现，在DNMT1表达抑制的细胞系中，RASSF1A的表达水平升高(图3B)。

2.5 DNMT1参与调控RASSF1A启动子区DNA甲基化状态

运用BGS及半巢氏PCR扩增DNMT1抑制前后细胞中RASSF1A启动子区，行克隆测序分析。利用DNA甲基化分析软件BiQAnalyzer分析所克隆序列中CpG位点甲基化变化情况，所检测区域中包含16个CpG位点(图4)。16个CpG位点总的测序结果分析显示，DNMT1的抑制没有明显改变RASSF1A启动子区的甲基化程度(P>0.05)。RASSF1A启动子区序列16个CpG位点经转录因子结合位点在线预测软件TFSEARCH预测其转录因子结合情况，发现第8、9个CpG位点和第14个CpG位点存在转录因子Sp1和USF结合的核苷酸序列(图4)。这些CpG位点在DNMT1抑制的细胞系SMMC-7721-DNMT siRNA中呈半甲基化状态，在其对照细胞系SMMC-7721-DNMT1对照组中呈完全甲基化状态。

图4BGS检测SMMC-7721-DNMT1siRNA细胞系及其的对照细胞中RASSF1A启动子区DNA甲基化状态变化

Fig4CpGsitesmethylationstatusoftheRASSF1ApromoterregionwasdetectedbyBGSinSMMC-7721celllinesthatknockdownDNMT1andthecontrolcells

3 讨 论

本研究发现，在HCC细胞系中，RASSF1A的表达水平明显低于正常肝细胞永生化细胞系及癌旁细胞系。该结果与前期文献中所报道的RASSF1A在HCC细胞系中的表达变化情况[8]一致，提示RASSF1A失活在肝癌的发生中可能发挥一定作用。此外，我们的研究还发现，在表达HBx的HCC细胞系MHCC-97H、MHCC-97L及HepG 2.215中，RASSF1A表达水平降低，暗示了RASSF1A的表达可能受HBx的影响。进一步研究发现，正常肝细胞永生化细胞系L02、HCC癌旁细胞系QSG-7701和HCC细胞系SMMC-7721中转染HBx基因使RASSF1A的表达水平也均有下降，提示HBx抑制了抑癌基因RASSF1A的表达，可能是HBx致HCC发生的分子机制之一。

在HCC中RASSF1A的启动子区DNA异常甲基化比率达到了80%以上[9]，启动子区DNA的异常甲基化被认为是RASSF1A失活的主要机制。基于此，本研究发现转染了HBx之后RASSF1A的表达水平均有所下降。以往研究显示，HBx可以诱导DNMT1的表达[10]，提示HBx影响RASSF1A的表达可能与DNMT1有关。我们在研究中发现，抑制DNMT1后RASSF1A的表达水平有所回复，提示RASSF1A的表达受DNMT1的调控。随后研究发现，DNMT1调节了RASSF1A启动子区DNA的甲基化状态，尤其改变了RASSF1A启动子区转录因子Sp1和USF结合位点的甲基化程度。Sp1是属于Sp/KLF家族的一类转录因子，由785个氨基酸构成，分子质量为100～110 kDa[11]；它可与DNA直接结合并增强基因的转录，其异常表达与多种肿瘤的发生发展有关[12]。USF是一类HLH(Helix-Loop-Helix)结构的转录因子，可以通过二聚体的形式与DNA结合，增强基因的转录活性[13]。USF是一种在细胞质中广泛分布的转录因子，在黑色素瘤中USF表达增强[14]。而CpG位点的甲基化可抑制USF与DNA序列的结合，进而使下游基因表达下调[15]。启动子区结合位点的DNA甲基化有可能对以上两种转录因子和DNA的结合产生抑制，从而导致RASSF1A表达的下调。

综上所述，在肝细胞及HCC细胞系中，HBx可能通过上调DNMT1的表达，进而改变RASSF1A的启动子区DNA甲基化状态以调控其表达。DNMT1影响RASSF1A启动子区DNA甲基化程度主要集中在其启动子区转录因子Sp1和USF结合位点，其具体机制尚需进一步探究。除此之外，HBx亦可能通过miRNA影响RASSF1A的表达[16]。尽管如此，DNMT1可能还存在其他途径调节RASSF1A的表达，尚需进一步的研究。

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