人参皂苷Rb1通过抑制炎症反应及氧化应激改善老年小鼠内皮功能

宋志明，余舒杰，巩贵宏，杨建涛，张海波，钱孝贤,4*

(1.河南大学第一附属医院 心内科，河南 开封475001；2.中山大学附属第三医院 心内科， 广东 广州510630；3.河南大学衰老与疾病研究所，河南 开封475001；4.中山大学中西医结合研究所，广东 广州510630)

老化是一种与炎症反应密切相关的日益进展的退行性过程。而炎症反应被认为是人类老化过程中起到核心作用，无论是自然性老化还是诸多老年相关性疾病，如动脉硬化、阿尔茨海默病和肿瘤等。炎症状态是心血管事件的风险因子，且随着人类年龄的增长炎症基因的表达逐渐增加。

在抗衰老治疗策略中，控制炎症被证实为一个关键措施。而年龄相关性系统性炎症是导致许多慢性疾病的共同机制，特异性的抑制促炎因子能够减少年龄相关性慢性疾病的发生和发展。我们既往研究发现，人参皂苷Rb1能够保护过氧化氢诱导的细胞衰老[1]。同时，减少氧化应激和炎症能够逆转高糖诱导的细胞衰老[2]。本研究旨在考察人参皂苷Rb1对于老年鼠体内炎症反应及氧化应激的作用，并探讨其对主动脉内皮功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

Rb1购自于成都普菲德生物技术有限公司。NO检测试剂盒、分型SOD活性及MDA检测试剂盒购自于南京建成生物公司。ICAM-1及MCP-1 Elisa试剂盒购自于BD公司。RNA提取Iso Plus试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。RevertAid逆转录试剂盒及DyNAmo ColorFlash SYBR GREEN qPCR Kit购自于美国Thermo公司。异丙醇、无水乙醇等为国产优级纯，购自广州化学试剂厂。引物由美国Life Technologies公司设计并合成。

1.2 动物分组及处理

40只雌性C57BL/6小鼠购自于中山大学实验动物中心，饲养于中山大学北校区动物实验中心。实验动物分为四组：①年轻对照组(3月，10只，Young)：每天腹腔注射无菌PBS；②老年PBS组(22月，10只，PBS old)：每天腹腔注射无菌PBS；③老年Rb1低剂量组(22月，10只，L Rb1)：按照10 mg Rb1/kg体重腹腔注射；④老年Rb1高剂量组(22月，10只，H Rb1)：按照20 mg Rb1/kg体重腹腔注射。进行腹腔注射时常规用酒精棉球消毒注射区域皮肤，腹腔注射总共持续6周。

1.3 动物标本采集

小鼠接受6周的处理，继续饲养3天后处死并收取标本。共有10只老年小鼠在标本采集前死亡，其中PBS old组死亡4只，L Rb1组死亡3只，H Rb1组死亡3只。所有小鼠给予10%水合氯醛600 mg/kg体重进行麻醉。

1.3.1血清的采集

小鼠麻醉后，用无齿弯镊拔出眼球进行取血。为防止毛发造成的溶血，提前用眼科剪剪去眼球周围的毛发。将盛有血的EP管放在管架上静置1小时，之后以3 000 rpm离心10分钟吸取上清，保存于-80℃冰箱备用。

1.3.2主动脉血管的剥离

眼球取血后将小鼠固定在手术台上。用弯剪剪开小鼠皮肤，暴露出内部脏器。先摘除肝脏、肾脏及肺脏等器官，然后剥离主动脉周围的组织使血管游离出来。尽可能近心脏部位剪断升主动脉，向下在髂总动脉分叉处剪断，保存于-80℃冰箱用于后续RNA的提取。

1.4 实时荧光定量PCR检测

于-80 ℃冰箱中取出各组实验样品，将主动脉血管置于匀浆器中充分研磨，应用RNA提取Iso Plus 试剂提取组织RNA，进行逆转录反应，再将制备好的cDNA 进行PCR 扩增。

PAI-1引物：上游为5’-TTC AGC CCT TGC TTG CCT C-3’，下游为5’-ACA CTT TTA CTC CGA AGT CGG T-3’；ICAM-1引物：上游为5’-GTG ATG CTC AGG TAT CCA TCC A-3’，下游为5’-CAC AGT TCT CAA AGC ACA GCG-3’；MCP-1引物：上游为5’-TTA AAA ACC TGG ATC GGA ACC AA-3’，下游为5’-GCA TTA GCT TCA GAT TTA CGG GT-3’；β-actin引物：上游为5’-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3’，下游为5’-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T-3’。反应条件为95 ℃ 7 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40 个循环，用RT-qPCR 反应体系扩增，使用SYBR Green RT-qPCR 相对定量的方法，比较各组管家基因β-actin 以及目的基因的循环阈值(Ct)值，以2-△△Ct值作为mRNA 的相对表达量。

1.5 酶联免疫吸附测定(ELISA)

以ELISA法检测各组小鼠血清ICAM-1、MCP-1含量，具体操作均严格参考试剂说明书进行。

1.6 血清SOD及MDA的测定

用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，采用硫代巴比妥比色法(TBA法)测定MDA，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 NO含量测定

采用试剂盒测定小鼠血清中NO含量，操作过程严格按照说明书进行。

1.8 统计学处理

通过SPSS16.0统计软件进行分析，定量资料用均数±标准差(mean±SD)表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进行组间两两比较时，若方差齐，采用LSD 检验；若方差不齐，采用K-W 检验。P<0.05 被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清中ICAM-1、MCP-1含量的比较

图1结果显示与年轻对照组相比，老年对照组小鼠血清中ICAM-1和MCP-1含量均明显升高；而Rb1高剂量处理组能一定程度上减少ICAM-1和MCP-1含量，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 各组小鼠主动脉组织中ICAM-1、MCP-1 、PAI-1 mRNA表达的比较

为进一步了解Rb1对老年小鼠血管组织中炎症的影响，我们对主动脉血管中炎症指标的mRNA进行了验证。结果显示与年轻小鼠相比，老年小鼠主动脉血管中的ICAM-1、MCP-1 、PAI-1 mRNA表达均明显升高。高剂量Rb1使三种基因mRNA表达均下降，而低剂量Rb1可以降低PAI-1 mRNA表达。这些结果提示老年小鼠主动脉组织中炎症反应增加，而合适剂量的Rb1能够在一定程度上减轻老年小鼠血管组织的炎症，见图2。

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group；&P<0.05 vs.PBS old group

2.3 各组小鼠血清中SOD1及MDA含量的比较

老年对照组小鼠血清中SOD1活性较年轻对照组减低，而MDA含量升高；Rb1高剂量处理组提高了老年鼠体内SOD1活性，并减少了MDA的含量(图3)。这些结果提示老年小鼠体内氧化应激水平增高，而高剂量Rb1能减轻老年小鼠的应激。

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group

2.4 各组小鼠主动脉组织eNOS mRNA表达及血清NO含量的比较

NO是一个广泛存在于心血管系统内的气体信号分子，它在调节内皮功能方面具有重要作用，是反应内皮功能的重要分子，而其产生主要收到eNOS的调控。因此，我们选择eNOS/NO作为检测指标来了解Rb1对于老年小鼠主动脉血管功能的影响。结果提示在老年小鼠主动脉血管中eNOS mRNA表达减少，与此同时血清中的NO含量减低，而给予高剂量Rb1能够提高eNOS mRNA合成并增加老年小鼠血清中NO的浓度(图4)。

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group

3 讨论

人参自古以来就被认为是一种增强机体抵抗力的中药。随着科技的发展，目前已有超过30余种的人参皂苷成分从人参中分离出来。人参皂苷已被证实具有减轻炎症的作用。但是人参中一些已知和未知的成分所带来的不良作用限制了人参在临床实践中的应用。为更明确每种皂苷的性能和功效，分离出来的皂苷单体能够规避人参成分复杂难以研究的困境。同时，人参皂苷Rb1是诸多皂苷中含量最多的一种[1]。我们既往研究也已证实人参皂苷Rb1能够通过Sirt1/eNOS/NO途径以及抑制氧化应激等方面逆转人脐静脉内皮细胞衰老[2,3]。本研究结果表明对于老年小鼠，人参皂苷Rb1具有减轻年龄相关性炎症反应和氧化应激水平的作用，促进主动脉组织eNOS/NO表达改善内皮功能。

在老年人群体内存在着长期持续的低水平炎症反应，一些炎症标志物如IL-1、ICAM-1和MCP-1都是随着年龄的增长而不断增加[4]。本研究同样发现，老年小鼠体内炎症反应较年轻小鼠明显升高。而年龄相关性炎症反应产生的原因，目前有两种解释：一是随着年纪的增加，免疫系统功能的不断下降；二是随着年龄增加，氧化还原状态的变化。我们的研究证实了第二个因素，老年小鼠体内氧化水平增高，进一步导致炎症反应增加。

从低等的秀丽线虫到高等的人类，随着年龄的增长氧化损伤都是逐渐加重的[5]。氧自由基、脂质代谢产物MDA在老龄化动物和人群中都是明显增加的，而抗氧化系统SOD等酶的活性却随着年龄的增长逐渐减弱[6]。我们的研究与这些结果一致，在老年小鼠体内SOD1活性减弱，MDA含量增加。然而，给予6周的人参皂苷Rb1处理后，老年小鼠体内的氧化应激水平有所减轻。

众所周知， NO是一个广泛存在于心血管系统内的气体信号分子，它在调节内皮功能方面具有重要作用[7]。NO产生主要受到eNOS的调控。与年轻人(20岁左右)相比，健康老年人(65岁以上)体内eNOS的活性明显减低[8]。在体外细胞衰老模型中，eNOS的活性降低，NO合成减少，而提高eNOS的活性可以减缓和减少内皮细胞的衰老[9]。我们的研究结果提示老年小鼠主动脉组织eNOS mRNA表达减少，血清中NO含量降低，这些结果与既往报道一致。人参皂苷Rb1能够增加eNOS mRNA表达，进而促进NO合成。

总之，本课题证实人参皂苷Rb1能够改善老年小鼠体内炎症水平，减轻氧化应激，增加NO合成，从而在一定程度上改善血管内皮功能。

作者简介：宋志明，32岁，男，博士，讲师，主要从事衰老与动脉硬化关系的研究；钱孝贤，教授，博士生导师，主要研究方向为冠状动脉疾病及动脉粥样硬化。

参考文献：

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[3]宋志明,王 敏,刘 勇,等.硫化氢通过抑制氧化应激改善高糖诱导的内皮细胞衰老[J].中国病理生理杂志,2014,30(8):1345.

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[9]宋志明，余舒杰，杨建涛，等.硫化氢通过调节Sirtl/eNOS信号通路延缓人脐静脉内皮细胞衰老[J].中国病理生理杂志，2018，34(2)：258.