龙岗区孕前人群G6PD缺乏症的分子流行病学研究

陈奕微,迟绍琴*,孙宇飞

(1.深圳市龙岗区妇幼保健院,广东 深圳518172;2.深圳华侨城医院)

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症是最常见的遗传性红细胞酶缺乏病,该酶活性的降低或缺乏易引发遗传性溶血性疾病,临床主要表现为急性溶血、遗传性非球形细胞性溶血性贫血、新生儿高胆红素血症、无症状携带者等。

目前诊断G6PD缺乏症普遍采用酶活性测定手段,如G6PD活性直接测定、G6PD/6PGD比值法等。这些方法虽然简便、快捷、廉价,但由于女性杂合子患者的G6PD活性往往正常或临界值,现有的临床检测方法对女性杂合子的检测存在漏诊现象[1,2]。所以通过对G6PD 缺陷症的筛查,进一步分子诊断对于指导优生优育,提高出生人口素质显得极为重要。本研究旨在通过研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因在深圳市龙岗区孕前人群中的主要突变类型、分布特点及表型,为该病在本地区的诊断及预防提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2015年3月至 2016年12月间参与龙岗区免费孕前优生健康检查10075名体检者的血标本(采集肘静脉血标本2 ml于EDTA抗凝采血管中),包括5027名男性,5048名女性。部分需要复核的标本在获得患者的知情同意之后,重新采集。新鲜全血用于酶活性检测,其余全血保存于-20℃备用。

1.2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性检测

采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)测定试剂盒(广州科方医疗器械有限公司,广州)于深圳迈瑞BS-800全自动生化分析仪进行G6PD/6PGD比值测定,严格按照试剂说明书操作。结果判读,成人活性正常者1.0-2.3,G6PD缺乏<1.0。

1.3 基因组DNA提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(广东凯普生物科技股份有限公司,广州)进行基因组DNA抽提,严格按照试剂说明书操作,获得的DNA-20℃保存备用。

1.4 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测

对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性检测初筛阳性样本437例(G6PD/6PGD比值<1),以及随机挑选G6PD/6PGD阴性样本535例进行葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测。

利用GeneAmp PCR System 9700扩增仪对DNA产物进行扩增,并利用医用核酸分子快速杂交仪(潮州凯普生物化学有限公司,广州)及潮州凯普生物化学有限公司生产的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)检测 14个中国人常见G6PD基因突变位点,分别为:c.95A>G、c.392G>T、c.493A>G、c.487G>A、c.592C >T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.871G >A、c.1004C>T、c.1024C>T、c.1387C>T、c.1388 G>A。严格按照试剂说明书操作,观察膜条上出现的蓝紫色斑点,进行结果判读。

1.5 统计学处理

采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析,计数资料以百分数(%)表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 G6PD缺乏症酶学筛查结果

龙岗区孕前人群G6PD缺乏症酶G6PD/6PGD比值法筛查的10075例孕前优生检查标本中,初筛阳性标本共437例,酶活性异常检出率为4.34%。其中男性228例(4.54%)、女性209例(4.14%),男,女阳性率比较χ2=0.546,P值为0.46>0.05,无统计学差异。

2.2 G6PD基因突变检测结果

对977例样本进行G6PD基因突变检测。芯片膜条探针位置以及代表性检测结果图1所示。

A：芯片探针位置示意图；B：代表性检测结果

2.3 基因检测结果

PCR+导流杂交法检测结果显示：972例(437例酶学筛查阳性样本及535例酶学阴性样本：女性样本374例,男性样本161例)进行基因检测的样本中,共检出突变标本664例。酶学筛查阳性样本基因异常检出率为97.25%,酶学阴性样本基因异常检出率为44.67%,见表1酶学筛查与G6PD基因突变检测结果统计。

表1 酶学筛查与G6PD基因突变检测结果统计

2.4 基因突变类型

此次检测共检出单点突变类型9种,含有195例c.1376G>T(29.37%),171例c.1388 G>A(25.75%),102例c.1311C>T(15.36%),67例c.95A>G(10.09%),27例c.1024C>T(4.07%),21例c.392G>T(3.16%),6例c.1360C>T(0.90%),c.487G>A及c.592C>T分别检测出1例；共检出复合突变73例(男13例,女60例)12种,含有28例G6PD文昌型c.871G>A/c.1311C>T(4.22%),18例c.1311C>T/c.1376G>T(2.71%),8例c.1311C>T/c.1388G>A(1.20%)等。此外,复合突变种包含两种三重复合突变,为c.871G>A/c.1311C>T/c.1388 G>A及c.871G>A/c.1311C>T/c.1376G>T,分别检出2例及1例；239例酶学筛查阴性而基因检测阳性标本中,男性28例均为c.1311C>T突变,女性则是多种突变类型,有单点突变和复合突变,其中,c.1311C>T突变为33.65%(杂合突变64例纯合突变7例)。664例样本G6PD基因突变类型统计结果见表2。

表2 664例样本G6PD基因突变类型统计结果

3 讨论

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏是X染色体连锁不完全显性方式遗传,其基因定位于Xq28。由于X染色体的伴性遗传,男性只有一条X染色体,当其带有G6PD缺乏症的致病基因时,称为半合子。当女性两条染色体都带有致病基因,称为纯合子；仅一条X染色体带有致病基因,称之为杂合子。在G6PD缺乏症筛查中,半合子的男性和纯合子女性及大多数杂合子女性的酶活性降低,均可以通过G6PD酶活性测定被检测到,但不能有效检出女性杂合子[3]。国内外研究早就证实G6PD基因突变杂合子是可以发病的[4]。因此G6PD 缺乏症女性杂合子的分子水平检测具有重要意义。

本研究中,采用传统酶学技术筛查深圳龙岗区孕前人群G6PD缺乏症发病率约为4.34%,男性4.54%,女性4.14%。G6PD/6PGD比值法筛查的10075例孕前优生健康检查标本中,男、女性检出率无明显区别(P>0.05)。女性杂合子G6PD酶活性变化较大,表现范围从正常至完全缺乏,该结果与其他报道一致[5]。对女性样本基因检测结果发现,G6PD酶活性阳性组,基因检测阳性率为96.65%,而酶学阴性的基因检测阳性率为56.42%,提示应用传统酶活检测女性杂合子漏检严重。

现已确定全世界超过180多种G6PD基因突变与G6PD缺乏症有关,中国已发现35种点突变[6]。可用于G6PD基因突变诊断的技术,目前有等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)、限制性酶切片段多态性(RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)以及DNA测序分析等。这些方法比较复杂,不适用于大面积的普查和快速诊断。国内尚缺乏对于G6PD缺乏症的大规模分子流行病学研究。本实验采用导流杂交技术检测样本G6PD基因6个外显子上14个常见突变位点,共检出21种突变类型,包含多种复合突变。共检测出10个位点的变异,分别为:c.95A >G、c.392G>T、c.487G>A、c.592C>T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.871G>A、c.1024C>T及c.1388G>A,该地区常见突变型为c.1376G>T、c.1388G>A、c.1311C>T、c.95A>G,与文献报道这几种基因型为临床常见型别一致[6]。除了102例c.1311C>T突变多态性外,c.1311C>T的复合突变类型广泛,提示该群体内1311多态性具有差异,主要以c.871G>A/c.1311C>T(28例)、c.1311C>T/c.1376G>T(18例)和c.1311C>T/c.1388G>A(8例)三种类型为主,女性复合突变多于男性。

对孕前、已怀孕夫妇进行G6PD缺乏症产前筛查和/或分子诊断,可以及早发现杂合子型女性G6PD缺乏者,有利于指导临床医生对该类孕妇正确用药,避免医源性损伤；为携带G6PD基因突变的夫妇提供遗传咨询和优生优育指导建议,及早对子代进行酶活性或基因检测,减轻G6PD缺乏症对新生儿造成的危害。本研究结果提示,分子水平的基因检测可以显著提高女性杂合子G6PD缺陷症的检出率,将有助于解决女性杂合子G6PD缺陷漏检的情况发生。

作者简介：陈奕微,女，38岁，临床医学检验主管技师，研究方向：临床医学生化免疫。

参考文献：

[1]朱冬林,朱远航,陈亚琼.2 种检测女性杂合子 G6PD 活性的方法比较和探讨[J].中国卫生检验杂志,2016,26(3):3868.

[2]Miao JK,Chen QX,Bao LM,et al.Determination of optimal cutoff value to accurately identify glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient heterozygous female neonates[J].Clin Chim Acta,2013,424:131.

[3]何天文,钟志成,黄滨梅.广东地区育龄人群葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查结果分析[J].国际检验医学杂志,2016,37(1):103.

[4]Kaplan M,Hammerman C,Vreman HJ,et al.Acute hemolysis and severe neontatal hyperbilirubinemia in glucose-6-phosphate dehydrognenase heterozygotes[J].J Pediatr,2001,139(1):137.

[5]莫 莉,蒙元劲,陶 静.G6PD/6PGD定量比值法检测新生儿女性杂合子的临床分析[J].中国优生与遗传杂志,2008,11:81.

[6]林 芬,杨 辉,杨立业.我国葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的分布特征和基因突变[J].分子诊断与治疗杂志,2016,8(2):73.