蛋白结合毒素与心血管疾病

周 蕾 综述 龚德华 审校

慢性肾脏病(CKD)，尤其是终末期肾病(ESRD)患者，由于肾功能减退，体内存在大量尿毒症毒素(UTs)蓄积。既往水溶性小分子及中分子UTs是研究的热点，近年来蛋白结合毒素(PBUTs)的重要性，尤其是它在CKD患者的心血管疾病(CVD)发生及发展中所起作用开始备受关注[1]。新近研究表明，PBUTs是心肾综合征发生的潜在的被忽视环节，可促进心血管系统及肾脏组织氧化应激、炎症及纤维化反应。降低血清中PBUTs浓度，可改善透析前患者血管硬化、颈动脉内膜中层厚度[2]，因此，充分认识蛋白结合毒素的产生、生物毒性及其清除方式，对其与心血管风险的研究具有重要的临床意义。本文就CKD患者PBUTs特性及其CVD机制研究进展做一综述。

蛋白结合毒素的产生

UTs主要来源于内源性代谢产生、微生物代谢产物及外源性摄入。肠-肾轴反映了PBUTs的主要生物合成过程，食物中的蛋白质降解，则是PBUTs产生的主要来源[3]。这些降解产物经肠道上皮细胞吸收及肝细胞进一步代谢后进入循环。目前研究较多的PBUTs如硫酸吲哚酚(IS)及硫酸对甲酚(PCS)产生过程如下：膳食中的酪氨酸和苯丙氨酸在肠道中发酵产生对甲酚(PC)，色氨酸代谢为吲哚，经肠道吸收、再经门静脉进入肝脏，在肝脏经硫酸化形成IS、PCS及葡萄糖醛酸苷对甲酚(PCG)(图1)[4]。

很早人们就发现，肾衰竭患者由于UTs蓄积导致血清蛋白(主要是白蛋白)的结合特性发生改变，并证实是由于一些毒素结合于蛋白所致(即PBUTs)。目前有32种分子被认为是PBUTs (www.uremic-toxins.org/DataBase.html)(表1)[5]。 目前研究较多的IS及PCS已证实在循环中通过静电、偶极及范德华力等非共价键与白蛋白竞争结合于相同位点，结合率分别达97%及95%[6]。肾小管主动分泌是PBUTs的主要排出途径。血液流经近端小管周围毛细血管时，PBUTs游离部分被小管基膜处有机阴离子转运体(OAT1和OAT3)及有机阳离子转运体(OCT2和OCT3)转运至胞内，随后通过顶端膜转运蛋白分泌入管腔，同时蛋白结合部分迅速解离以保持结合/游离的动态平衡，从而实现PBUTs的大量清除[7]。由于许多经OATs转运的药物与毒素竞争性分泌，在CKD患者中需谨慎使用。

因此，CKD患者PBUTs的升高，主要由于肠-肾轴改变(即肠道生化环境、微生态改变)导致产生增加及肾小管分泌减少两方面原因所致。

图1 肠-肾轴[4]食物中的蛋白质水解后，产生的酪氨酸和色氨酸经肠道菌群发酵，分别产生对甲酚及吲哚，经门脉系统吸收入肝脏，经肝脏转化为硫酸对甲酚和硫酸吲哚酚。两者在循环中以游离和结合白蛋白的形式存在，并可作用于心脏、肾脏及内皮细胞

名称蛋白结合率(%)血清浓度(mg/L)CNCUCU/CN3-羧基-4-甲基-5-丙基-2呋喃丙酸≥984.60±1.8026±105.60马尿酸603±2109±6536.50硫酸对甲酚981.90±2.3023±1712.30葡萄糖醛酸对甲酚<400.085±0.0568.50±1.90104吲哚乙酸90～980.50±0.302.00±0.404.10葡萄糖醛酸吲哚酚40～800.95±0.402.90±2.903.10硫酸吲哚酚970.50±4.0037±2668.30犬尿氨酸NA0.390.69±0.181.80犬尿喹啉酸90～980.006±0.0010.15±0.0827.60苯乙酸40～801.4475±45339葡糖醛酸苯酚甙40～80-0.60±0.10NA喹啉酸-0.10±0.051.50±0.9015腐胺NA0.010±0.0050.06±0.025.80

CN：健康人；CU：尿毒症；NA：无数据

蛋白结合毒素对心血管系统的影响

IS是一种具有心血管和肾脏毒性的物质，可促进转化生长因子β(TGF-β)和胶原的编码，促进肾小管间质纤维化，影响肾小管功能，加速CKD进展[8]。此外，IS具有促炎和促氧化的特性，是预测CKD患者心血管事件发生的标志物[8]，参与了CKD患者至少6种类型的CVD的发生、发展[9]，包括动脉粥样硬化、动脉硬化、充血性心力衰竭、心律失常、血管通路血栓形成及外周动脉疾病。氧化应激和一氧化氮(NO)缺乏是CKD患者内皮损伤的重要机制。实验证实，IS通过诱导人类血管内皮细胞(HUVECs)NADPH氧化酶生成，促进自由基的释放，是其心血管效应产生的主要机制[9]。

与IS相似，PCS与CKD进展和心血管事件的发生相关。在一项纳入499例轻至中度CKD患者的前瞻性研究中发现，高游离PCS浓度是独立于肾小球滤过率以外，患者心血管事件发生的危险因素[10]。Meta分析表明，PCS及IS均与患者死亡相关，但PCS还与CVD死亡相关[11]。IS及PCS两种PBUTs心血管及肾脏影响的机制列于下表中(表2)[12]。

硫酸吲哚酚硫酸对甲酚对心脏的影响 促进心肌成纤维细胞胶原形成及心肌细胞蛋白合成;促进心肌纤维化,导致左心舒张功能障碍对心脏的影响 促进心肌纤维化及心肌肥厚,促进心肌细胞凋亡,导致左心舒张功能障碍对血管的影响 诱导并增强氧化应激,促进ROS生成及NADPH氧化酶活性,促进体外培养的HUVEC衰老;促进p16(INK4a)、p21 (WAF1/CIP1)、p53等衰老相关蛋白及视网膜神经胶质瘤蛋白表达增加;促进血管平滑肌细胞转化为成骨细胞对血管的影响 诱导Rho激酶介导的HUVES微颗粒释放,促进内皮功能障碍;增加血管内皮对白蛋白的通透性对肾脏的影响 促进肾脏炎性细胞因子相关基因表达增加,激活促纤维化基因,促进肾脏氧化应激及近端小管细胞核因子κB激活及ROS合成增加,下调Klotho表达,从而促进肾小球硬化及肾脏间质纤维化对肾脏的影响 促进肾脏炎性细胞因子相关基因表达,激活促纤维化基因,下调Klotho表达,从而促进肾小球硬化及肾脏间质纤维化

ROS：活性氧；NADPH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；HUVEC：人类脐带静脉内皮细胞

蛋白结合毒素的检测

PBUTs在CKD患者尤其是ESRD患者体内蓄积，并产生心肾毒性，实时监测溶质浓度是了解透析充分性及有效性的有力手段。高效液相色谱法(HPLC)联合质谱分析(MS)是检测UTs的标准方法，应用水解酶水解、锌酸钠盐置换溶质等方式将PCS及IS等溶质与结合蛋白分离后，在可控的实验室环境中可对PC、PCS及IS毒素水平进行定量分析[13]。一些光学和电化学传感器检测包括电势检测和伏安法，可用于在线多胺、甲酚及吲哚等溶质监测装置研制中[14]。由于PCS并不具有电化学活性，因此伏安法并不能直接测量PCS的浓度，具有电化学活性的IS及PC可通过伏安法检测[14]。

HPLC联合MS无法作为临床常规检测项目开展，因此目前还缺乏适于常规检测及透析过程中实时监测的手段。电化学检测方法应用实时监测还有待进一步完善及与标准检测方式之间测量值的校准。

降低蛋白质结合毒素的措施

由于PBUTs蛋白结合率高，常规血液净化清除效率低，依赖一些特殊手段(主要是吸附)增加其清除。此外，通过肠道干预减少毒素产生及吸收，保护残余肾功能以增加自身对此类毒素的清除都是降低PBUTs的重要措施。

血液净化清除常规血液透析(HD)方式只能清除游离溶质，而游离部分的清除导致蛋白结合毒素解离及释放，因此以游离部分来计算，这些毒素的透析清除率远高于一般溶质及血流量，可达500 ml/min以上，但由于其游离分数较小，因此PBUTs总溶质清除率则非常低，仅为20～30 ml/min。而正常肾脏对游离及总IS的清除率分别为2 776±1 190 ml/(min·1.73m2)及58±18 ml/(min·1.73m2)[15]。同时，PBUTs在体内的分布容积远远大于血浆容积是透析对此类物质清除效率低的另一原因[16]。由于总体清除率都较低，因此不同透析模式之间清除率的一些差异，如采用血液透析滤过(HDF)模式，增加透析液流量可能使清除率略增加，临床意义并不大。长时、高频透析可明显增加PBUTs清除，但其临床意义仍需进一步观察。

腹膜透析(PD)尽管透析清除率并不高，但PCS水平显著低于高通量血液透析患者，可能与较好地保护了残余肾功能相关。对于有残余肾功能的PD患者，IS清除率为4.18 L/(W·1.73 m2)，PCS清除率为2.17 L/(W·1.73 m2),相应尿素清除率为67.5 L/(W·1.73 m2)[17]。

吸附方式是清除PBUTs的主要手段。现有的吸附治疗模式，如血液灌流、血浆成分分离吸附(FPSA)虽可能增加清除，但如何更好地结合透析模式则是研究的重点。一项体外实验显示，透析液(流量42±3 ml/min)中增加活性炭可使PCS的清除从4 ml/min增加至9 ml/min[18]。为解决活性炭可能吸附于膜的透析液侧孔、降低清除效率的问题，一种新型的双层混合基质透析器已在研制中。这种透析器内膜层孔径较小，可通过透析液而无法通过活性炭颗粒，外膜层则为活性炭，从而改善生物相容性，初步实验结果显示可增加对IS及对PCS的清除[19]，尚待进一步动物及临床试验来验证其效果。

增加游离分数也是增加PBUTs清除的可能手段。PBUTs通过非共价键与血浆白蛋白结合，毒素与蛋白之间的作用力不强。有研究采用高渗盐水置换液，使进入滤器时血浆Na+浓度提高至240 mmmol/L，从而增加血浆离子强度以减弱溶质和结合蛋白之间的静电作用，结果显示游离IS的清除率增加40%，而游离PCS清除增加不明显[20]。这种方式对患者钠平衡的影响、高渗的溶血风险及实际临床效果都有待进一步研究。其他增加游离分数的方法还包括竞争性结合蛋白结合位点，以减少IS及PCS与白蛋白的结合[21]。但是使用的竞争性结合药物的合适浓度、药代动力学、对其他蛋白结合毒素的清除能力的影响及临床可行性亦需进一步的研究验证。

肠道干预如上所述，PBUTs大多是氨基酸在肠道菌群作用下的代谢产物，机体的尿毒症状态对肠道微生态及肠功能的影响显著增加了毒素的产生，因此抑制结肠内毒素的产生也是控制血清PBUTs水平的干预靶点。采用低蛋白饮食[0.3 g/(kg·d)]，并辅以酮酸类似物及必须氨基酸以维持机体正氮平衡，可显著降低血浆中IS的浓度[21]。

通过服用益生元、益生菌、合生元等肠道微环境调节制剂，调节肠道内细菌的生长和代谢，使肠道益生菌成为优势菌群，可抑制致病菌生长及毒素产生[22]。研究发现口服肠道微环境调节制剂后血液中IS和PCS等物质的浓度有一定程度的降低，同时能改善胰岛素抵抗、排便困难等相关症状。

AST-120是一种新型口服活性炭吸附剂，由球形的碳颗粒组成，对胃肠道内吲哚、P-甲酚等PBUTs前体具有很高的亲和力，从而阻止PBUTs前体进入血液经肝脏代谢为IS、PCS等毒素[23]。在Schulman等[24]设计的多中心，随机、双盲、安慰剂对照的试验中，132例中至重度CKD患者随机分入口服AST-120三种剂量组(0.9 g、2.1 g、3.0 g，3次/d)及安慰剂组(3次/d)，最终6.3 g/d及9.0 g/d的治疗剂量组血清IS水平的降低程度显著优于对照组，证实AST-120降低血浆IS的水平呈剂量依赖性。但是该试验研究规模小，并且未将肾脏预后及患者生存率等作为硬终点。在CKD动物实验中，口服AST-120能抑制蛋白尿、肾小球肥大、间质纤维化和CKD的进展，临床试验也发现AST-120能有效延迟晚期CKD患者进入透析阶段。日本的一项多中心、双盲Ⅲ期药物临床试验显示，口服AST-120治疗2周后患者的尿毒症症状(恶心、纳差、皮肤瘙痒及口臭等)得到改善，治疗24周后血清肌酐倒数(1/SCr)的斜率显著增大，但由于观察时间太短，还无法评估肾脏硬终点，即进入透析时间[25]。但也有大型RCT发现，中至重度CKD患者在标准治疗方法基础上加用AST-120并无明显获益[26]。目前，AST-120在CKD及ESRD患者治疗中的作用并不明确。

尽管还缺乏明确循证医学证据，通过干预肠道尿毒症代谢产物的生成及吸收从而减少UTs是一个值得努力的方向。

保护残余肾功能残余肾功能是影响肾脏替代治疗(无论HD还是PD)患者预后的重要因素。残余肾功能的存在，除了能更好地控制容量负荷外，对溶质的清除，特别是一些透析清除效率低的溶质，起着非常重要作用。对于PBUTs而言，残余肾小管分泌功能至关重要。Marquez等[27]发现HD患者残余肾功能对马尿酸盐清除的影响更大。

小结：随着PBUTs对CVD机制的相关证据越来越多，除血清肌酐、尿素氮外，PBUTs可考虑作为评估透析充分性的又一指标。由于其血浆蛋白结合率高的特性，现有的标准HD方法不能有效清除，需进一步研究特殊清除手段(如吸附)；此外，经肠道干预控制尿毒素产物在肠道的生成及吸收也是值得研究的措施。在目前还无其他有效手段清除及控制PBUTs水平的现状下，保护残余肾功能是非常重要的措施。当然，PBUTs的临床意义，各种干预措施的有效性都还待更多的研究进一步证实。

1 Vanholder R,Schepers E,Pletinck A,et al.The uremic toxicity of indoxyl sulfate and p-cresyl sulfate:a systematic review.J Am Soc Nephrol,2014,25(9):1897-1907.

2 Nakamura T,Kawagoe Y,Matsuda T,et al.Oral ADSORBENT AST-120 decreases carotid intima-media thickness and arterial stiffness in patients with chronic renal failure.Kidney Blood Press Res,2004,27(2):121-126.

3 Li DY,WHW T.Contributory Role of Gut Microbiota and Their Metabolites Toward Cardiovascular Complications in Chronic Kidney Disease.Semin Nephrol,2018,38(2):193-205.

4 Ketteler M,Block GA,Evenepoel P,et al.Executive summary of the 2017 KDIGO Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD) Guideline Update:what's changed and why it matters.Kidney Int.2017;92:26-36.Kidney Int,2017,92(6):1558.

5 Jansen J,Jankowski J,Gajjala PR,et al.Disposition and clinical implications of protein-bound uremic toxins.Clin Sci (Lond),2017,131(14):1631-1647.

6 Itoh Y,Ezawa A,Kikuchi K,et al.Protein-bound uremic toxins in hemodialysis patients measured by liquid chromatography/tandem mass spectrometry and their effects on endothelial ROS production.Anal Bioanal Chem,2012,403(7):1841-1850.

7 Masereeuw R,Mutsaers HA,Toyohara T,et al.The kidney and uremic toxin removal:glomerulus or tubule?Semin Nephrol,2014,34(2):191-208.

8 Niwa T.The protein metabolite theory as a mechanism for the progression of renal failure.J Ren Nutr,2001,11(4):181-182.

9 Hung SC,Kuo KL,Wu CC,et al.Indoxyl Sulfate:A Novel Cardiovascular Risk Factor in Chronic Kidney Disease.J Am Heart Assoc,2017,6(2)，pii:e005022.

10 Meijers BK,Claes K,Bammens B,et al.p-Cresol and cardiovascular risk in mild-to-moderate kidney disease.Clin J Am Soc Nephrol,2010,5(7):1182-1189.

11 Lin CJ,Wu V,Wu PC,et al.Meta-Analysis of the Associations of p-Cresyl Sulfate (PCS) and Indoxyl Sulfate (IS) with Cardiovascular Events and All-Cause Mortality in Patients with Chronic Renal Failure.PLoS One,2015,10(7):e0132589.

12 Lekawanvijit S,Kompa AR,Wang BH,et al.Cardiorenal syndrome:the emerging role of protein-bound uremic toxins.Circ Res,2012,111(11):1470-1483.

13 De Smet R,David F,Sandra P,et al.A sensitive HPLC method for the quantification of free and total p-cresol in patients with chronic renal failure.Clin Chim Acta,1998,278(1):1-21.

14 Filik H,Avan AA,Aydar S.Voltammetric Sensing of Uremic Toxin Indoxyl Sulfate Using High Performance Disposable Screen-Printed Graphene Electrode.Current Pharmaceutical Analysis,2016,12(1):36-42.

15 Sirich TL,Funk BA,Plummer NS,et al.Prominent accumulation in hemodialysis patients of solutes normally cleared by tubular secretion.J Am Soc Nephrol,2014,25(3):615-622.

16 Martinez AW,Recht NS,Hostetter TH,et al.Removal of P-cresol sulfate by hemodialysis.J Am Soc Nephrol,2005,16(11):3430-3436.

17 Huang WH,Hung CC,Yang CW,et al.High correlation between clearance of renal protein-bound uremic toxins (indoxyl sulfate and p-cresyl sulfate) and renal water-soluble toxins in peritoneal dialysis patients.Ther Apher Dial,2012,16(4):361-367.

18 Meyer TW,Peattie JW,Miller JD,et al.Increasing the clearance of protein-bound solutes by addition of a sorbent to the dialysate.J Am Soc Nephrol,2007,18(3):868-874.

19 Pavlenko D,van Geffen E,van Steenbergen MJ,et al.New low-flux mixed matrix membranes that offer superior removal of protein-bound toxins from human plasma.Sci Rep,2016,6:34429.

20 Krieter DH,Devine E,Körner T,et al.Haemodiafiltration at increased plasma ionic strength for improved protein-bound toxin removal.Acta Physiol (Oxf),2017,219(2):510-520.

21 Tao X,Thijssen S,Levin N,et al.Enhanced Indoxyl Sulfate Dialyzer Clearance with the Use of Binding Competitors.Blood Purif,2015,39(4):323-330.

22 Vanholder RC,Eloot S,Glorieux GL.Future Avenues to Decrease Uremic Toxin Concentration.Am J Kidney Dis,2016,67(4):664-676.

23 Yamagishi S,Nakamura K,Matsui T,et al.Oral administration of AST-120 (Kremezin) is a promising therapeutic strategy for advanced glycation end product (AGE)-related disorders.Med Hypotheses,2007,69(3):666-668.

24 Schulman G,Agarwal R,Acharya M,et al.A multicenter,randomized,double-blind,placebo-controlled,dose-ranging study of AST-120 (Kremezin) in patients with moderate to severe CKD.Am J Kidney Dis,2006,47(4):565-577.

25 Yamaguchi J,Tanaka T,Inagi R.Effect of AST-120 in Chronic Kidney Disease Treatment:Still a Controversy? Nephron,2017,135(3):201-206.

26 Schulman G,Berl T,Beck GJ,et al.Randomized Placebo-Controlled EPPIC Trials of AST-120 in CKD.J Am Soc Nephrol,2015,26(7):1732-1746.

27 Marquez IO,Tambra S,Luo FY,et al.Contribution of residual function to removal of protein-bound solutes in hemodialysis.Clin J Am Soc Nephrol,2011,6(2):290-296.