miRNA-155在阑尾炎及肠道免疫调节中的作用

西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西 西安 710061

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-155 in the appendicitis and intestinal immunomodulation,in order to understand its clinical significance in the development of disease.MethodsOne hundred patients with appendicitis were selected as appendicitis group from Jun. 2014 to Jun. 2017 in the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, according to the disease type, all patients were divided into 30 cases of pure type, 45 cases of fester type, 25 cases of gangrene type, 30 healthy people were selected as control group at the same time, the peripheral blood CD4+CD25+regulatory T lymphocytes (Treg) level was detected by flow cytometry, the peripheral blood interleukin-10 (IL-10) level was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), the peripheral blood miRNA-155 level was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method.ResultsThe levels of peripheral blood Treg, IL-10, miRNA-155 in appendicitis group were significantly lower than those in control group, the gangrene type group was significantly lower than that in fester type group, the fester type group was significantly lower than that in pure type group, the difference was statistically significant (P<0.05).Pearsoncorrelation analysis showed that, miRNA-155 levels were positively correlated with Treg, IL-10 levels (P<0.05).ConclusionmiRNA-155 may be involved in the proliferation of Treg cells in intestinal immune regulation, and it also causes the Treg cells to secrete IL-10 to participate in the immune inflammatory response of appendicitis.

【Keywords】 microRNA-155; Appendicitis; Intestinal immunomodulation; CD4+CD25+regulatory T lymphocytes; Interleukin-10

阑尾炎是临床上常见的一种腹部炎症疾病，居各种急腹症的首位，多由阑尾梗阻使上管腔内细菌侵入受损肠黏膜引起局部免疫炎症反应所致，常伴有食欲不振、恶心、呕吐等症状，严重者可导致死亡。而有研究显示，外周血CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Treg)是调节性T细胞亚群之一，可直接参与机体的免疫应答及免疫反应，并可介导白介素-10(IL-10)等细胞因子的分泌而调节局部炎症反应。同时，研究显示，微小RNA(miRNA)参与人体的多种生物学过程，其中miRNA-155的表达与Treg细胞的增殖密切相关，提示其在机体免疫调节中具有重要的调控作用。对此，本研究通过检测患者外周血miRNA-155、Treg、IL-10水平，探讨miRNA-155在阑尾炎及肠道免疫调节中的作用，以了解其在疾病发展转归中的临床意义。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2014年6月至2017年6月西安交通大学医学院第一附属医院确诊并治疗的阑尾炎患者100例作为阑尾炎组，选取同期健康体检人员30名作为对照组。纳入标准：(1)经临床症状、病史、实验室、血常规、影像学等检查证实存在或不存在阑尾炎；(2)年龄18～60岁，无精神病病史；(3)检查前1个月无抗凝、免疫、抗感染、激素等治疗史；(4)研究对象签署知情同意书。排除标准：(1)有血液、免疫、神经等系统严重性疾病；(2)妊娠期、哺乳期女性或有恶性肿瘤者；(3)有心、肝、肾等严重性疾病；(4)拒绝参与本次研究。本次研究经我院伦理委员会审批且通过。对照组：年龄22～58岁，体质量指数(BMI)19.24～30.79 kg/m2，心率(HR)64～104次/min，平均动脉压(MAP)75～110 mmHg。阑尾炎组：年龄20～59岁，BMI 19.34～30.89 kg/m2，HR 63～105次/min，MAP 74～109 mmHg。依据疾病类型分为单纯型30例、化脓型45例、坏疽型25例，就诊时间(12.43±5.24)h(2～38 h)。两组在性别、年龄、BMI、HR、MAP等资料上比较,差异无统计学意义(P>0.05，见表1)，具有可比性。

表1 两组一般资料比较 Tab 1 Comparison of general data between two groups

1.2主要试剂和仪器miRNA提取分离试剂盒、miRNA-155和内对照引物、cDNA第1链合成试剂盒及荧光定量检测试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒、Perfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒均购自美国Invitrogen有限公司，Facscalibur流式细胞仪及其配套试剂购自美国BD公司，IL-10试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：对照组于早晨空腹情况下、阑尾炎组患者于就诊后2 h内，抽取上臂静脉血9 ml置入无菌抗凝试管中，并送至冷冻库于-30 ℃保存备用，在检测前2 h统一解冻。

1.3.2 miRNA-155检测：样本解冻后，取3 ml通过miRNA 提取分离试剂盒采用Trizol一步法提取总RNA，并反转录合成cDNA，将1 μl的cDNA置于10 μl反应体系中进行扩增反应，94 ℃进行2 min，通过胶回收法纯化DNA片段作为标准品，采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测外周血中单个核细胞miRNA-155水平，各基因引物序列及扩增产物长度如表2所示，采用标准曲线法计算mRNA表达量，以U6、β-actin为内参物，并计算其相对表达量(U6和β-actin校正值)，以上操作均严格按照试剂盒相关说明书的规定进行。

1.3.3 Treg细胞检测：样本解冻后，取3 ml与适当比例的荧光标记的相应抗体混匀后室温避光孵育20 min，加2 ml红细胞裂解液混匀后室温避光孵育10 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加2 ml磷酸盐缓冲液混匀后，洗涤，加500 μl磷酸盐缓冲液重悬后，立即通过流式细胞仪检测，测定时以前向散色光、侧向散色光设定淋巴细胞门R1，配套的Cell Quest Pro软件测定Treg细胞水平，以上操作均严格按照试剂盒相关说明书的规定进行。

表2 不同基因引物序列及其扩增产物长度Tab 2 Sequence of different gene primers and the length of the amplified product

基因引物序列扩增产物长度/bpmiRNA-155上游:5'-CGTTAATGCTAATCGT-GATAG-3'84下游:5'-GCAGGGTCCGAGGT-3'U6上游:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'70下游:5'-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3'β-actin上游:5'-GTAAAGACCTCTATGC-CAACA-3'150下游:5'-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3'

1.3.4 IL-10检测：样本解冻后，取3 ml行血清分离(3 000 r/min，10 min)后，取上清液，加IL-10试剂，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-10，在450 nm处测吸光度(OD)值，所有测得值减去空白值后，通过绘制标准曲线计算IL-10水平，以上操作均严格按照试剂盒相关说明书的规定进行。

2 结果

2.1 两组外周血Treg、IL-10、miRNA-155水平比较

在外周血Treg、IL-10、miRNA-155水平方面，阑尾炎组明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表3 两组外周血Treg、IL-10、miRNA-155水平比较Tab 3 Comparison of Treg, IL-10 and miRNA-155 levels in the peripheral blood between two groups

2.2不同阑尾炎类型的外周血Treg、IL-10、miRNA-155水平比较在外周血Treg、IL-10、miRNA-155水平方面，坏疽型明显低于化脓型，化脓型明显低于单纯型，差异均有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表4 不同阑尾炎类型的外周血Treg、IL-10、miRNA-155水平比较Tab 4 Comparison of Treg, IL-10 and miRNA-155 levels in the peripheral blood among different appendicitis

阑尾炎类型例数Treg/% IL-10/(ng/L) miRNA-155 单纯型 303.36±0.3868.74±7.211.38±0.15化脓型 452.92±0.34*46.32±4.87*1.06±0.12*坏疽型 252.46±0.31*#34.25±4.25*#0.91±0.09*#F值 16.46818.46720.462P值 <0.001<0.001<0.001

注：与单纯型比较，*P<0.05；与化脓型比较，#P<0.05。

2.3miRNA-155水平与Treg、IL-10水平的Pearson相关性分析Pearson相关性分析结果显示，miRNA-155水平与Treg、IL-10水平呈正相关(r=0.743、0.704,P<0.001，见图1～2)。

3 讨论

阑尾是自大肠初段长出的管状器官，阑尾炎是其最常见的炎症疾病，也是临床上一种因多种因素形成炎性改变的最常见急腹症，以青年最为多见，男性多于女性，可导致腹痛、压痛、反跳痛等症状。目前，阑尾炎治疗以手术为佳，可有效控制病情，但近年来有研究[6-7]显示，发生初期除低热、乏力外，多无明显的全身症状，若未能及时有效治疗，局部的炎症反应会加剧对阑尾的损伤，严重者可发展至化脓、坏疽，甚至可引起弥漫性腹膜炎，大大增加患者死亡的风险。

图1 miRNA-155水平与Treg水平的Pearson相关性分析Fig 1 Correlation analysis of the miRNA-155 level and the Treg level in Pearson

图2 miRNA-155水平与IL-10水平的Pearson相关性分析 Fig 2 Correlation analysis of the miRNA-155 level and the IL-10 level in Pearson

有研究[8]表明，阑尾炎在发生、发展阶段，除临床症状、体征等发生变化外，患者体内的多种细胞及因子也随之出现一系列的生理、病理变化，且通过检查这些细胞及因子对了解疾病的发展转归及指导早期正确诊治以改善患者预后具有重要的临床价值。而有研究[9-10]显示，机体免疫系统所介导的免疫炎症反应在阑尾炎的发生、发展中起重要作用，阑尾内分泌物积存、细菌感染等因素，会引起肠道的局部免疫应答，促使T细胞等免疫细胞的增殖而刺激、分泌大量的免疫炎性因子，从而导致阑尾局部剧烈的炎症反应和损伤。而Treg是一类具有调节功能的成熟T淋巴细胞亚群，可通过主动调节的方式调节，抑制存在正常机体内潜在的自身反应T细胞的活化、增殖和促进抗炎因子分泌，有利于阻止免疫炎症损伤和维持免疫耐受[11-12]。同时，血清白介素则是反映机体免疫炎症状态的重要因子，其中IL-10是一种具有多功能的细胞因子，其可调节促炎因子与抗炎因子之间的平衡，提示其在炎症反应中具有重要的调控作用[13-14]。此外，有研究[15-16]显示，Treg细胞的增殖受miRNA的表达调控，其中miRNA-155是一种经典的多功能miRNA，对Treg增殖具有调控作用，且对活化T细胞分泌的细胞因子具有调节作用，其异常表达与免疫稳态异常引发的炎症反应有关，提示其在局部免疫炎症反应中发挥重要的作用。

对此，本研究通过检测患者外周血miRNA-155、Treg、IL-10水平，发现在上述指标水平方面，阑尾炎组明显低于对照组，坏疽型明显低于化脓型，化脓型明显低于单纯型，Pearson相关性分析结果显示，miRNA-155水平与Treg、IL-10水平呈正相关，表明外周血miRNA-155、Treg、IL-10水平与阑尾炎的发生、发展有关；这可能是由于在阑尾炎的发生、发展过程中，阑尾内分泌物积存、细菌感染等因素，不仅会引起肠道的局部免疫应答，还可能会引起机体免疫调节功能异常，使机体肠道免疫调节处于免疫反应亢进、免疫抑制和促炎、抗炎反应的动态演变之中[17-18]；而随着病情发展，反复的免疫动态演变可能会使机体出现复杂的免疫紊乱和动态失衡状态，加之阑尾内分泌物积存、细菌感染等持续存在并刺激免疫炎症反应，可能会导致免疫反应亢进增强从而使促炎反应占主导地位，使miRNA-155等miRNA表达受抑制而影响其对Treg的增殖调控作用，导致Treg未能有效抑制病灶区域的自身反应T细胞活化、增殖，同时会使其所刺激的IL-10等抗炎因子分泌减少[19-20]，从而使阑尾局部炎症反应不断加剧；且随病情进展，阑尾的局部炎症反应会损伤其黏膜组织，进而导致化脓，甚至坏疽的发生，严重增加弥漫性腹膜炎及患者死亡发生的风险。

本研究存在一定的局限性，如阑尾炎引起患者免疫功能异常及其所致局部炎症反应发生等机制复杂，且此试验纳入样本量小，不能完全代表所有病例的实际情况，但miRNA-155可能是阑尾炎患者免疫失衡调控网络中的一个位点，而其调控作用在哪些环节和水平上、或在何种程度上发挥作用仍不清楚，其确切的作用机制及靶向调控信号通路有待进一步深入研究。因此，miRNA-155及其对阑尾炎患者肠道免疫调节的作用可能是指导临床诊治该疾病的热点。

综上所述，miRNA-155可能参与肠道免疫调节中对Treg细胞的增殖，并促使Treg细胞分泌IL-10抑制阑尾炎的免疫炎症反应的发生、发展。

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